Аффинно очищенные антитела что это такое


Что такое анаферон. Аффинно очищенные антитела к человеческому интерферону гамма

Весна — пора простуд и вирусных инфекций. Но если вы пойдете в аптеку, то обнаружите, что на полке с противовирусными препаратами примерно половина содержимого — пустышки, не имеющие никакого отношения к лекарствам. Мошенники от фарминдустрии зарабатывают миллиарды на вашей доверчивости.

Ладно еще разработанные в перестроечное время российские препараты, не имеющие доказательств эффективности по международным нормам доказательной медицины, а только несколько отечественных работ (речь идёт о пресловутом арбидоле и, например, циклофероне), но на полках множество средств по определению не являющихся лекарствами или противовирусными препаратами, хотя бы просто потому, что в них нет действующих веществ, они пустышки. Речь идёт о гомеопатии типа анаферона, оциллококцинума, афлубина и эргоферона. И если по первым двум информации в интернете море (да достаточно заглянуть хотя бы в википедию: Оциллококцинум , Анаферон), то с эргофероном давайте разберемся подробнее. Можно почитать его инструкцию, это очень занимательное занятие.

Небольшое отступление. Речь идёт о гомеопатии, у которой много активных сторонников (хотя правильнее было бы сказать адептов, или верующих). Давайте расставим все точки над i:

Научное сообщество расценивает гомеопатию как мошенничество, ссылаясь на отсутствие научных основ этого метода лечения болезней. Теоретическое обоснование гомеопатического принципа не соответствует научным представлениям о функционировании здорового и больного организма, а осуществлённые клинические испытания гомеопатических препаратов не выявили различий между гомеопатическим лекарством и плацебо. Тривиальные вычисления показывают, что препараты в разведениях 12C и выше с большой вероятностью не содержат ни одной молекулы действующего вещества.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) предостерегает от гомеопатического лечения инфекционных и любых других серьёзных заболеваний. Как отмечают эксперты организации, «использование гомеопатии не имеет доказательной базы, а в тех случаях, когда применяется в качестве альтернативы основному лечению, оно несёт реальную угрозу здоровью и жизни людей».

Читаем состав эргоферона — все красиво, убедительно, и дозы серьёзные:

Все вроде бы неплохо, но что-то смущает. А что это за звёздочка? А это сноска, и ниже её расшифровка, напечатанная, разумеется мелким-мелким шрифтом. Ох уж эти сноски и мелкий шрифт… Давно пора приравнять такие методы к мошенничеству.

* наносятся на лактозу в виде смеси трех активных водно-спиртовых разведений субстанции, разведенной соответственно в 100 12 , 100 30 , 100 50 раз.

Стоп-стоп-стоп! То есть если примерно посчитать, то получается что одна молекула действующего вещества содержится в ста миллионах таблеток? Другими словами, вероятность встретить действующее вещество в таблетке меньше, чем вероятность быть убитым метеоритом! Получается, что за 200-300 рублей вы покупаете только вспомогательные вещества, из которых состоит таблетка: лактозы моногидрат, целлюлоза микрокристаллическая, магния стеарат, которые никакими лечебными свойствами не обладают.

Читаем дальше. В описании фармакологической активности везде употребляется выражение «компоненты, входящие в препарат », и идёт описание что про них «экспериментально доказано, что: ». Обратите внимание: речь идёт о компонентах препарата (антителах, которых, как мы выяснили в нём просто нет), а не о самом препарате в целом. На это фоне фраза «Совместное применение компонентов комплексного препарата сопровождается усилением противовирусной активности входящих в него компонентов. » выглядит просто издевательством. Да, я понимаю, что эти антитела имеют лечебную эффективность, но каким образом это имеет отношение к вашему препарату?

Ну и самый шедевр:

Чувствительность современных физико-химических методов анализа (газо-жидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия) не позволяет оценивать содержание сверхмалых доз антител в биологических жидкостях, органах и тканях, что делает технически невозможным изучение фармакокинетики препарата Эргоферон.

Разумеется, трудно найти чёрную кошку в тёмной комнате, если её там нет.

Обидно, что эти заведомо не относящиеся к лекарствам субстанции в аптеке лежат среди лекарственных препаратов, и приносят своим создателям-мошенникам миллиардные прибыли от доверчивых буратин-покупателей.

Что из себя представляет «Анаферон» на самом деле? Оправдано ли его поголовное применение? Может ли он навредить? На эти вопросы довольно часто приходится отвечать известному детскому доктору Евгению Комаровскому.

Справка

Евгений Олегович Комаровский - педиатр высшей категории, родившийся на Украине. Получил широкую известность после серии публикаций и книг для взрослых о детском здоровье. Обладает редким для врачей талантом - разъяснять далеким от медицины родителям простым языком сложные вещи. Это заметили представители медиа-пространства, теперь Комаровский - известный телеведущий, автор программы «Школа доктора Комаровского» и автор рубрики о здоровье на «Русском Радио». Живет на Украине. Доктор пользуется огромной популярностью у миллионов мам и пап на территории России и стран СНГ, а также за рубежом.

О препарате

«Анаферон» – гомеопатическое средство. Дозы действующих веществ в растворах в нем представлены в ничтожно малых количествах.

Как любое другое гомеопатическое средство, «Анаферон» почти не имеет побочных действий и противопоказаний, во всяком случае, об этом говорит инструкция по применению.

В аптеках продают таблетки для рассасывания или разжевывания «Анаферон» и «Анаферон детский». Не стоит быть великим сыщиком и обладать невероятным методом дедукции, чтобы понять, что разделение на взрослую и детскую дозировку - не более чем маркетинговый ход, поскольку концентрация основного действующего вещества в них абсолютно одинаковая - 3 мг. Это написано на упаковках.

В инструкции указывается на то, что «Анаферон» обладает иммуномодулирующим действием и иммуностимулирующим эффектом в отношении вирусов. Кроме того, подчеркивается, что средство усиливает иммунный ответ на клеточном уровне, правда, совершенно не указан механизм такого воздействия, как это делают в инструкциях в официальным аптечным препаратам.

Производители рекомендуют начинать принимать препарат как можно раньше - при первых признаках начинающегося гриппа или ОРВИ по особой схеме - первые 2 часа - каждые полчаса по таблетке, затем еще три приема через одинаковые временные промежутки, и потом - по таблетке трижды в сутки до выздоровления.

В целях профилактики «Анаферон» рекомендуется принимать в течение 1-6 месяцев дважды в год по 1 таблетке в день в периоды увеличения заболеваемости острыми респираторными инфекциями.

Эффективность

Надо заметить, что у всех противовирусных препаратов с доказанной в клинических условиях эффективностью большая проблема. А у гомеопатических средств она вдвое больше. Если верить информации, размещенной на сайте производителя «Анаферона», клинически препарат все-таки испытывали, несмотря на то, что гомеопатические средства обычно не исследуют в лабораторных условиях, поскольку в них минимальные дозы действующих веществ, и такое исследование становится попросту невозможным по этой причине.

Итак, есть данные об испытаниях «Анаферона» на группе детей медиками Санкт-Петербурга и Новосибирска. Но в обоих случаях не указана численность испытуемых, точные возрастные рамки эксперимента, а потому отчеты об испытаниях не содержат конкретных цифр статистики, напоминают сочинение на тему «Как «Анаферон» снизил заболеваемость», и всерьез учеными и фундаментальными медиками восприниматься не могут.

Комаровский об «Анафероне»

Евгений Комаровский к «Анаферону» относится довольно иронично, подчеркивая, что востребованность препарата держится не на его эффективности, а на спросе покупателей. Это гомеопатическое средство Евгений Олегович считает совершенно бесполезным. Это не категоричное отрицание, а констатация фактов - Комаровский уверен, что его коллеги - педиатры назначают «Анаферон» столь часто потому, что отлично знают о его бесполезности, а значит, и полной безвредности.

В результате, доктор спокоен, ведь, как говорится, «вреда никакого и пользы никакой», и родители спокойны - малыш получает «лечение». Срабатывает эффект «плацебо». В результате иммунитет ребенка самостоятельно справляется с вирусами, как того и следовало ожидать, а положительный исход приписывают сладковатым таблеткам «Анаферона».

А вот собственно и выпуск доктора Комаровского где детский врач все нам расскажет о детских противовирусных.

Если верить отзывам тех мам, чьим деткам «Анаферон» помог, то вирусная инфекция у них отступила на 4-5 сутки. Комаровский подтверждает, что именно столько времени нужно иммунитету ребенка, чтобы справиться с болезнетворным вторжением извне. Если иммунная защита малыша слаба, то болезнь затягивается, и о таких случаях на просторах Интернета родители пишут, что «Анаферон» не помог. Иными словами, тот же самый эффект был бы, если бы родители не давали ребенку вообще никаких лекарств.

По поводу профилактического применения препарата Комаровский вообще протестует, поскольку никакое средство, включая гомеопатическое, нельзя принимать на протяжении полугода.

Количество действующего вещества крайне мала, подчеркивает известный доктор, чтобы вылечить хоть что-то, зато содержание сахара в каждой таблетки довольно большое. Складывается впечатление, что ребенка производители «Анаферона» стараются лечить именно сахаром. А это полный абсурд.

Всем родителям предлагаем посмотреть выпуск доктора Комаровского о самолечении.

    Отказ от применения «Анаферона», в том числе его детского варианта. Это пустая трата денег, считает доктор. Лучше эту сумму (около 150 рублей) потратить на фрукты для заболевшего ребенка, пользы от них будет куда больше.

    Отказ от других гомеопатических средств. Их эффективность для детей и взхрослых не доказана, за результат, возникший при применении, Минздрав не отвечает. Испытания, проведенные по инициативе фирмы- изготовителя, обычно проводятся с нарушением всех критериев, важных для испытания медикамента.

    Если ребенок заболел гриппом или ОРВИ, лучшее, что могут для него сделать родители, создать благоприятные условия для выздоровления. Чаще поить теплыми компотами, чаем, отварами, следить за достаточной увлажненностью воздуха в детской комнате, обеспечить малышу постельный режим. При тяжелом течении болезни, обязательно пригласить на дом педиатра.

    Чтобы карапуз не заболел гриппом, вовсе не обязательно для профилактики принимать гомеопатические средства, в том числе и детский «Анаферон». Будет значительно полезнее, если ребенок начнет чаще гулять на свежем воздухе, заниматься спортом, получать полноценное питание, богатое витаминами и микроэлементами.

    Если ваш участковый педиатр все-таки назначает ребенку «Анаферон», Комаровский рекомендует попросить такого специалиста обосновать, чем именно этот гомеопатический препарат поможет вашему ребенку. Вряд ли педиатр найдется, что обоснованно ответить на этот вопрос. Для профилактики

Выпускают Анаферон для взрослых и Анаферон детский, оба препарата производят в виде таблеток для сублингвального применения (по 20 шт. в контурных ячейковых упаковках, в картонной пачке 1 упаковка).

В состав препарата входят аффинно очищенные антитела к человеческому интерферону гамма – 3 мг.

Показания к применению

Анаферон (как для взрослых, так и для детей) показан:

  • Комплексная терапия смешанных и бактериальных инфекций;
  • Лечение ОРВИ, гриппа, хронической и острой цитомегаловирусной и герпесной инфекций;
  • Лечение и предупреждение иммунодефицитных состояний и инфекций, осложнений ОРВИ, гриппа.

Противопоказания

Анаферон противопоказан при непереносимости его компонентов.

В период беременности и лактации препарат назначается с осторожностью.

Способ применения и дозировка

Анаферон взрослым назначают по 1 таблетке от 3 до 6 раз в сутки, при признаках улучшения состояния можно принимать препарат 1 раз в сутки на протяжении 8-10 дней.

Анаферон детский назначают, начиная с месячного возраста ребенка.

При респираторных заболеваниях при появлении первых симптомов применение Анаферона происходит по следующей схеме: в первые 2 часа каждые 30 минут по таблетке и еще 3 таблетки на протяжении первых суток. Далее следует принимать по 1 таблетке 3 раза в сутки до полного выздоровления.

Для профилактики бактериальных осложнений назначают Анаферон по 1 таблетке 1 раз в сутки натощак в течение 8-12 дней.

При приеме препарата таблетку не глотают до полного ее растворения, а для детей от месяца до 3-х лет средство растворяют в столовой ложке кипяченой воды.

Побочные действия

При применении Анаферона редко возникают побочные действия. В отдельных случаях препарат может вызывать повышенную чувствительность к компонентам, входящим в его состав.

Особые указания

Так как в состав средства входит лактоза, не рекомендуется применение Анаферона пациентам с синдромом мальабсорбции глюкозы, с врожденной галактоземией или лактазной недостаточностью.

Аналоги

Аналогами препарата являются средства Амиксин и Циклоферон.

Сроки и условия хранения

Анаферон следует хранить в сухом и темном месте, недоступном для детей, при температуре, не превышающей 25 °C.

Срок годности – 3 года.

Анаферон таб. д/рассас n20

Анаферон детский таблетки 20 шт.

Анаферон таблетки 20 шт.

Анаферон гомеопатический №20 таблетки

Анаферон гомеопатический детский №20 таблетки

Анаферон таблетки для рассасывания n20 таб

Анаферон детский таблетки для рассасывания n20

Информация о препарате является обобщенной, предоставляется в ознакомительных целях и не заменяет официальную инструкцию. Самолечение опасно для здоровья!

Татьяна, на Анаферон можете не грешить в том смысле, что он не усиливает симптомы ОРВИ, другое дело что он их и не ослабляет - просто никак не действует. Это лекарство с недоказанным действием.

Если бы ваша печень перестала работать, смерть наступила бы в течение суток.

Многие наркотики изначально продвигались на рынке, как лекарства. Героин, например, изначально был выведен на рынок как лекарство от детского кашля. А кокаин рекомендовался врачами в качестве анестезии и как средство повышающее выносливость.

Люди, которые привыкли регулярно завтракать, гораздо реже страдают ожирением.

Ученые из Оксфордского университета провели ряд исследований, в ходе которых пришли к выводу, что вегетарианство может быть вредно для человеческого мозга, так как приводит к снижению его массы. Поэтому ученые рекомендуют не исключать полностью из своего рациона рыбу и мясо.

Печень – это самый тяжелый орган в нашем теле. Ее средний вес составляет 1,5 кг.

Согласно исследованиям, женщины, выпивающие несколько стаканов пива или вина в неделю, имеют повышенный риск заболеть раком груди.

Общеизвестный препарат «Виагра» изначально разрабатывался для лечения артериальной гипертонии.

Вес человеческого мозга составляет около 2% от всей массы тела, однако потребляет он около 20% кислорода, поступающего в кровь. Этот факт делает человеческий мозг чрезвычайно восприимчивым к повреждениям, вызванным нехваткой кислорода.

На лекарства от аллергии только в США тратится более 500 млн долларов в год. Вы все еще верите в то, что способ окончательно победить аллергию будет найден?

Согласно мнению многих ученых, витаминные комплексы практически бесполезны для человека.

У 5% пациентов антидепрессант Кломипрамин вызывает оргазм.

Большинство женщин способно получать больше удовольствия от созерцания своего красивого тела в зеркале, чем от секса. Так что, женщины, стремитесь к стройности.

Раньше считалось, что зевота обогащает организм кислородом. Однако это мнение было опровергнуто. Ученые доказали, что зевая, человек охлаждает мозг и улучшает его работоспособность.

Препарат от кашля «Терпинкод» является одним из лидеров продаж, совсем не из-за своих лечебных свойств.

Если улыбаться всего два раза в день – можно понизить кровяное давление и снизить риск возникновения инфарктов и инсультов.

Каждый раз, когда у ребёнка поднимается температура, болит горло, появляется насморк и кашель, родителей беспокоит вопрос – это обычная простуда или грипп? В эт.

Аффинно очищенные антитела к человеческому интерферону гамма

Антитела к Гамма Интерферону Человека Аффинно Очищенные

Медицина и Фармацевтика

Антитела к Гамма Интерферону Человека Аффинно Очищенные – сложное название, поэтому буду рассказывать по порядку что, где и как работает. Самое простое в названии это Антитела к Гамма Интерферону Человека. Тут я буду максимально короток – речь идёт о наборе Антител, которые стимулирую выработку клетками Гамма-Интерферона. Гамма Интерферон - это такая молекула сложного белка, которую производит зараженная вирусом клетка. Производит клетка этот белок, чтобы он разлетался к другим клеткам и сообщал им: «У нас враг, все на боевую готовность!». После такого сигнала начинается разгон иммунитета человека и выработка других видов Интерферона, чтобы предотвратить развитие заражения.

Название «Человека» просто говорит о том, что данные Антитела подойдут лишь для стимуляции Интерферона производимого человеком (у других животных другой Интерферон). Аффино Очищенные – это довольно сложное определение, точнее описывание процесса. Я попытаюсь сказать наиболее просто – это говорит о том, что Антитела «свободны» в плане молекулярных связей, то есть в близи с клетками у них не будет никаких проблем для присоединения к рецепторам, а значит и будет выполнена их работа на отлично. Данное соединение так же подходит для профилактики вирусных заболеваний типа Гриппа

сами антитела не опасны, вред может нанести Интерферон вырабатываемый клетками – в больших количествах он может сделать клетки невосприимчивыми ко всему, даже к связи с другими клетками, что может привести к развитию страшных заболеваний органов и нервной системы, поэтому обычно используется сам Интерферон в определённых дозах;

данную форму препарата обычно используют в гомеопатии и там концентрация крайне мала, что может вообще вызвать сомнение об эффективности, а об опасности вообще не может идти и речи

Этот Котейка Грустит!

Нажми на Котейку - я пропаду!

Этот Котейка Грустит!

Нажми на Котейку - я пропаду!

Комментарии

Случайные Тэги

Обратная связь

Этот Котейка Грустит!

АНТИТЕЛА К ГАММА ИНТЕРФЕРОНУ ЧЕЛОВЕКА АФФИННО ОЧИЩЕННЫЕ

АНТИТЕЛА К ГАММА ИНТЕРФЕРОНУ ЧЕЛОВЕКА АФФИННО ОЧИЩЕННЫЕ - форма выпуска, состав и упаковка

субстанция -раствор (замороженный).

пробирки полипропиленовые (1) - пакеты полиэтиленовые.

пробирки полипропиленовые (2) - пакеты полиэтиленовые.

пробирки полипропиленовые (3) - пакеты полиэтиленовые.

пробирки полипропиленовые (4) - пакеты полиэтиленовые.

пробирки полипропиленовые (5) - пакеты полиэтиленовые.

*Описание препарата основано на официально утвержденной инструкции по применению и утверждено компанией-производителем для изданий 2012 года

АНТИТЕЛА К ГАММА ИНТЕРФЕРОНУ ЧЕЛОВЕКА АФФИННО ОЧИЩЕННЫЕ - описание и инструкция предоставлены справочником лекарственных средств «Видаль»

Трудно одерживать победы в неравной борьбе с мракобесием, которое пытается проникнуть не только в общество, но даже в науку. Тем приятней, когда поражения разбавляются приятными новостями. Недавно организаторы «Дня биолога» Биологического факультета МГУ прислушались к мнению бывших выпускников, коллег и неравнодушных читателей социальных сетей и отменили презентацию от фирмы «Материа Медика Холдинг», которая производит препараты, считающиеся гомеопатическими.

Процитирую достойную реакцию организационного комитета:

«Мы выражаем вам благодарность за желание сделать мероприятие лучше и вместе с тем приносим извинения за свою невнимательность: за всем не уследишь, поэтому мы особенно дорожим конструктивной критикой с вашей стороны. Лекция и стенд компании «Материя Медика» в рамках программы Дня Биолога отменены. Объясняем по порядку. Первоначальная инициатива компании выступить на факультете была связана действительно с желанием осветить тему трудоустройства в фармацевтической отрасли, что особенно поощрялось администрацией факультета и потому было пропущено организационным комитетом. Но ваши комментарии пробудили дух справедливости в команде, мы проверили информацию и пришли к коллективному решению, которое также поддержала администрация, что выступление компании с такой репутацией на биологическом факультете недопустимо. Мы против гомеопатии и за коллективное стремление делать мир лучше. Спасибо ещё раз, ваш Оргкомитет».

Новость попала в некоторые СМИ , поэтому польза была двойной.

В этой статье я расскажу немного о проблемах науки и о том, чем же занимается эта фирма с плохой репутацией.

Компания «Материа Медика» запатентовала и зарегистрировала множество гомеопатических средств, например, анаферон - от вирусных инфекций, артроферон - от болезней суставов, анфала - от воспалений, импаза - от импотенции. В какой-то момент компания решила скрыть гомеопатическую природу своей продукции. На упаковках пишут «активные компоненты - 0.003г», а дальше сноска: «наносятся на лактозы моногидрат в виде водно-спиртовой смеси с содержанием не более 10 в степени -15 нг/г активной формы действующего вещества». В итоге активное вещество оказывается разведенным в 10 в степени -26 раз. Препарат ничего не содержит, но больной об этом не догадывается.

Такой же подход используется для публикации статей о препарате в международных рецензируемых научных журналах - гомеопатическая природа исследуемого средства скрывается. Судя по количеству статей по теме и ошибкам, которые в них можно обнаружить - сокрытие информации в сочетании с очень невнятным описанием экспериментов позволяет усыпить бдительность рецензентов.

Рассмотрим пример - статью, опубликованную в журнале PloS ONE . В ответ на вирусные инфекции человеческий организм вырабатывает особые белки - интерфероны, в том числе интерферон-гамма. «Действующее вещество» исследуемого препарата - антитела к интерферону-гамма, то есть молекулы, связывающие этот белок, но гомеопатически разведенные. Авторы называют это релиз-активными формами антител или сокращенно «РА формами». Использованные термины создают иллюзию «научности» подхода.

В статье утверждается, что добавление РА форм к обычным антителам, взятым в измеримой концентрации, влияет на способность последних связываться с интерфероном. Эффект показан с помощью иммуноферментного анализа - химические реакции происходят на особом микропланшете с большим количеством лунок. В одни лунки к интерферону добавляются антитела вместе с РА формами, а в другие - антитела с контрольным раствором.

Проблема в том, что шум измерений использованного прибора неравномерно распределен по микропланшету, что приводит к «эффекту положения»: в одних лунках реакция может идти чуть-чуть быстрее, чем в других. Например, из-за градиентов температуры. Этот факт известен специалистам по иммуноферментному анализу, как минимум, с 1979 года . Предложено несколько способов избавиться от ошибки. Один из метод называется «пространственная рандомизация »: экспериментальные и контрольные образцы наносятся в случайно выбранные лунки и ошибки усредняются. Другой способ: экспериментальные и контрольные образцы наносятся в лунки чередующимися линиями.

Если все экспериментальные образцы поместить с одной стороны, а контрольные с другой, как это сделали авторы обсуждаемой работы, то разница в измерениях будет объясняться не волшебным действием гомеопатически разведенных антител, а «эффектом положения». Но авторы не используют методов рандомизации или ослепления и получают заведомо ошибочный вывод, который используется в маркетинговых целях.

Мы с коллегой написали более подробный разбор данной статьи и отправили его в журнал PloS ONE. Редакторы обещали разобраться, но пропали. Поэтому мы выложили свою рецензию как комментарий к статье на английском языке. Еще один редактор PLoS ONE профессор Джеймс Койн поддержал нас и написал в своем блоге, но и это не заставило журнал хоть как-то отреагировать. И это речь о неплохом в целом журнале. Во многих местах дела обстоят намного хуже.

Проблемы, связанные с нарушением научного метода мы находили и других работах по «скрытой гомеопатии». Один наш отзыв опубликовал журнал Medical Virology . Все это - одна из множества иллюстраций сложности научного подхода, которая войдет в будущую книгу о причинах веры в паранормальные явления.

Директор компании «Материя Медика» доктор медицинских наук, профессор Олег Эпштейн недавно стал членом-корреспондентом Российской академии наук. В 2016 году он стал членом диссертационного совета Д.001.003.01 «Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии».

Любопытна и история роста количества научных публикаций Эпштейна. Например, в 2003 году он стал автором 49 научных статей в журнале «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» в специальном выпуске, в котором сам был редактором. Вскоре он защитил докторскую. До этого я смог найти лишь одну статью Эпштейна в медицинской базе данных PubMed.

Сама компания процветает и приносит миллиардные доходы на сахаре (десятки тысяч рублей за килограмм). Но самый печальный вывод заключается в том, что уровень рецензирования во многих научных журналах, которые принято считать «приличными», не выдерживает критики. Что уж говорить про «науки», где все строится на «личном опыте». Поэтому может и не стоит удивляться существованию странных научных советов. Ведь и по гомеопатии активно ведется «научная работа» со всеми возможными нарушениями.

В 2005 году профессор Джон Иоаннидис опубликовал эпохальную статью в журнале PloS Medicine, которая рекомендуются к прочтению всем, кто интересуется и занимается наукой. Работа называется: «Почему большинство опубликованных научных результатов ошибочны» . По данным журнала Nature, большинство ученых утверждают, что не смогли воспроизвести некоторые опыты коллег . Предпочтение рассказывать о положительных результатах, необходимость писать больше статей, маленькие выборки и ошибки статистического анализа - вот проблемы науки, о которых сейчас все больше и больше говорят.

В науке существует кризис. Я описал один пример. Второй - , которая сегодня была успешно защищена. Еще один набор проблем раскрывает проект Диссернет, показавший коррумпированность целых научных советов и даже ректоров ВУЗов. Нет сомнений, что под вершиной айсберга откровенной паранаучной ерунды скрывается и гораздо большая, но менее заметная «подводная часть».

Итак, гомеопатия, скрытая гомеопатия, теология. Ждем астрологию. И тогда сбудется последнее пророчество моей антиутопии - апофении , когда государство заменит ученых шаманами. Легализацию колдунов , а за призывы уничтожать ученых не наказывают.

Но лучше, и тут я обращаюсь ко всем уважаемым коллегами, что-то начать делать. Хотя бы высказываться, а не терпеть, когда науку попирают. Пока всех нормальных специалистов не уволили. Как гомеопаты Дениса Рощина, осмелившегося выступить против лженауки сверхсильных разведений.

Литература:

1. Epshtein O: Method of treating viral diseases https://google.com/patents/US8815245 2011.2. Gavrilova ES et al: Novel approach to activity evaluation for release-active forms of anti-interferon-gamma antibodies based on enzyme-linked immunoassay. PLoS One 2014, 9(5):e97017.3. Burt SM et al: Thermal characteristics of microtitre plates used in immunological assays. J Immunol Methods 1979, 31(3-4):231-6.4. Roselle C et al: Mitigation of microtiter plate positioning effects using a block randomization scheme. Anal Bioanal Chem 2016, 408(15):3969-79.5. Harrison RO, Hammock BD: Location dependent biases in automatic 96-well microplate readers. J Assoc Off Anal Chem 1988, 71(5):981-7.6. Dueva EV, Panchin AY: Homeopathy in disguise. Comment on Don et al.: Dose-dependent antiviral activity of released-active form of antibodies to interferon-gamma against influenza A/California/07/09(h2N1) in murine model. J Med Virol 2017, 89(7):1125-6.7. Ioannidis JP: Why most published research findings are false. PLoS Med 2005, 2(8):e124.

8. Baker M: 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature 2016.

ola2.ru

выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Эта заявка претендует на эффект по предварительной заявке США № 61/196753 от 20 октября 2008г., полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы очистки моноклональных антител фармацевтического качества, получаемых из ферментирующей культуры, обычно включают четыре основных стадии. Эти стадии включают: (1) сбор/осветление-отделение клеток-хозяев от ферментирующей культуры; (2) захват-отделение антитела от большинства компонентов осветленного продукта; (3) доочистку-удаление остаточных примесей и агрегатов из клеток-хозяев; и (4) приготовление состава-введение антитела в соответствующий носитель для максимальной стабильности и времени хранения.

Однако эти стадии часто не приводят к композиции антитела с чистотой, достаточной для использования в фармацевтике. Поэтому в настоящий момент необходимы способы получения и очистки представляющих интерес антител в достаточно чистой форме, подходящих для использования в фармацевтике. Настоящее изобретение направлено на эту цель.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на способы выделения и очистки антител из образца культурального материала. В некоторых аспектах изобретение направлено на способы очистки антител, в которых используется аффинная хроматография, предпочтительно хроматография на основе белка А. В определенных аспектах в способах по настоящему изобретению используют стадию инактивации кислотой, стадию аффинной хроматографии и одну или более дополнительных стадий хроматографии и/или фильтрации. Хроматографические стадии могут включать одну или более стадий ионообменной хроматографии и/или хроматографии гидрофобных взаимодействий. Кроме того, настоящее изобретение направлено на фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, очищенных описанным в настоящем документе способом.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения направлен на способ очистки антитела или его антигенсвязывающего участка из образца культурального материала, в котором полученная композиция антитела по существу свободна от белков клетки-хозяина («БКХ»). В одном аспекте культуральный материал включает продукт клеточной линии, причем клеточную линию используют для продукции специфических антител по настоящему изобретению. В конкретном аспекте образец культурального материала (или просто образец) получают из клеточной линии, используемой для продукции антител к IL-12; в другом аспекте образец культурального материала получают из клеточной линии, используемой для продукции антител к TNF ; и в еще одном аспекте образец культурального материала получают из клеточной линии, используемой для продукции антител к IL-18.

Один способ по настоящему изобретению включает подведение рН в образце культурального материала, содержащем потенциально представляющее интерес антитело или его антигенсвязывающий участок. В одном аспекте рН подводят до кислых значений рН. Примером подходящего рН является показатель рН между примерно 3 и 5, предпочтительно рН примерно 3,5. Это первичное выделение проводят отчасти для уменьшения количества или инактивации рН-чувствительных вирусов. Кроме снижения количества и/или инактивации вирусов, кислые условия облегчают удаление клеток и клеточного дебриса, в результате чего образуется первичный выделенный образец. После соответствующего отрезка времени рН можно подвести до более нейтрального или основного значения и провести аффинную хроматографию, предпочтительно хроматографию на основе белка А, первичного выделенного образца. В одном аспекте образец после аффинной хроматографии собирают и дополнительно проводят последовательные стадии хроматографической очистки, такой как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобных взаимодействий.

В одном варианте осуществления изобретения стадия аффинной хроматографии включает нанесение первичного выделенного образца на колонку, содержащую подходящий носитель для аффинной хроматографии. Неограничивающие примеры таких хроматографических носителей включают, но не ограничены ими, смолу на основе белка А, смолу на основе белка G, аффинные носители, содержащие антиген, к которому получали представляющее интерес антитело, и аффинные носители, содержащие Fc-связывающий белок. Для аффинной очистки и выделения антител (IgG) пригодна смола на основе белка А. В одном аспекте колонку на основе белка А уравновешивают соответствующим буфером до нанесения образца. Примером соответствующего буфера является Tris/NaCl-буфер с pH примерно 7,2. После уравновешивания образец можно нанести на колонку. После нанесения на колонку ее можно промыть один или несколько раз, используя, например, буфер для уравновешивания. Перед элюцией с колонки можно использовать другие промывки, включая промывки другими буферами. Затем образец можно элюировать с колонки на основе белка А, используя соответствующий элюирующий буфер. Примером подходящего элюирующего буфера является буфер, содержащий уксусную кислоту и NaCl, с рН примерно 3,5. Элюцию можно контролировать с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Например, можно наблюдать за поглощением при 280 нм (OD280 ). Представляющие интерес элюированные фракции(ию) затем можно подготовить для дополнительной очистки.

В одном варианте осуществления изобретения за аффинной хроматографией на основе белка А следует ионообменная стадия. Эта ионообменная стадия представляет собой катионный или анионный обмен или их комбинацию. Эта стадия может представлять собой одну процедуру ионообмена или может включать несколько ионообменных стадий, таких как катионообменная стадия, за которой следует анионообменная стадия, или наоборот. В одном аспекте ионообменная стадия представляет собой одностадийную процедуру. В другом аспекте ионообменная стадия представляет собой двухстадийный ионообменный процесс. Подходящей катионообменной колонкой является колонка, неподвижная фаза которой включает анионные группы. Примером такой колонки является Fractogel SO3 -. Эта стадия ионообменной захватывающей хроматографии облегчает выделение антител из образца. Подходящей анионообменной колонкой является колонка, неподвижная фаза которой включает катионные группы. Примером такой колонки является колонка Q Sepharose . Одна или более ионообменных стадий дополнительно очищают антитела, снижая содержание примесей, таких как белки и ДНК клеток-хозяев, и при необходимости содержание белка из аффинного носителя. Эту процедуру анионного обмена проводят хроматографией в режиме проскока, при котором целевые антитела не взаимодействуют с анионообменной смолой (или твердой фазой) или не связывают ее. Однако многие примеси взаимодействуют с анионообменной смолой или связываются с ней. В конкретном аспекте ионообменная стадия представляет собой анионообменную хроматографию.

Элюат после аффинной хроматографии подготавливают для ионообмена, подводя рН и ионную силу в буфере для нанесения образца. Например, рН элюата после аффинной хроматографии можно подвести до показателя от примерно 6,0 до примерно 8,5 1М Tris-буфером. Перед нанесением образца (элюата после аффинной хроматографии) на ионообменную колонку ее можно уравновесить, используя подходящий буфер. Примером подходящего буфера является Tris/NaCl-буфер с рН от примерно 6,0 до примерно 8. После уравновешивания на колонку можно нанесли элюат после аффинной хроматографии. После нанесения колонку можно промыть один или несколько раз подходящим буфером. Примером подходящего буфера является сам буфер для уравновешивания. К сбору проскока можно приступать, например, когда поглощение (OD280 ) поднимется выше примерно 0,2 AU.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в настоящий способ включена дополнительная стадия. Эта стадия включает использование хроматографии гидрофобных взаимодействий («ХГВ»). Подходящей колонкой является колонка, у которой неподвижная фаза содержит гидрофобные группы. Примером такой колонки является колонка со смолой Phenyl-Sepharose (фенил-сефарозой). В ходе процесса выделения/очистки возможно образование агрегатов целевых антител. Эта стадия гидрофобной хроматографии облегчает удаление этих агрегатов. Она также способствует удалению примесей. В процедуре используется высокосолевой буфер, который усиливает взаимодействие антител (или их агрегатов) с гидрофобной колонкой. Элюцию с колонки осуществляют более низкими концентрациями соли.

В еще одном варианте осуществления изобретения элюат после ХГВ фильтруют через фильтр для удаления вирусов, такой как фильтр Ultipor DV20 . Эта процедура отделяет вирусные частицы из элюата после колонки с фенил-сефарозой для снижения количества вирусов (если таковые присутствуют) до безопасного уровня. В этом варианте осуществления изобретения можно использовать фильтры, хорошо известные специалистам в данной области.

Чистоту интересующих антител в полученном образце продукта можно проанализировать, используя способы, хорошо известные специалистам в данной области, например, гель-фильтрацию, ВЭЖХ-анализ на колонке Poros A, БКХ-ELISA (твердофазный ИФА на белки клеток-хозяев), белок A-ELISA (твердофазный ИФА на белок А) и Вестерн-блот анализ.

В еще одном варианте осуществления изобретение направлено на одну или более фармацевтических композиций, содержащих выделенное антитело или его антигенсвязывающий участок и приемлемый носитель. В другом аспекте композиции дополнительно содержат один или более фармацевтических агентов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведены последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из неограничивающего примера антитела к IL-12 (ABT-847).

На фиг. 2 приведены последовательности тяжелой и легкой цепей из неограничивающего примера антитела к IL-18 (ABT-325).

На фиг. 3 приведены последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей из неограничивающего примера антитела к TNF (Адалимумаба).

На фиг. 4 изображена типичная хроматограмма, показывающая чистоту продукта из биореактора объемом 300 л после использования хроматографии на основе белка А (на смоле MabSelect ) для захвата антител к IL-12 и снижения примесей в продукте и примесей, связанных с процессом, таких как одиночные и двойные фрагменты легкой цепи, белки и ДНК клеток-хозяев СНО и т.д.

На фиг. 5 приведена оценка условий промывки MabSelect .

Фиг. 6 представляет собой фотографию разделения в полиакриламидном геле осадков, полученных после подведения рН элюата с MabSelect до 8 и проводимости до 7 мСм/см.

На фиг. 7 представлен типичный хроматографический профиль проскока с хроматографической колонки Q Sepharose FF в масштабе биореактора 300 л.

На фиг. 8 представлен типичный хроматографический профиль элюции с хроматографической колонки Phenyl Sepharose НР в масштабе биореактора 300 л.

На фиг. 9 показаны результаты анализа динамической обменной емкости, в результате которого было установлено, что 10%-ная точка проскока для смолы MabSelect составляет 37,4 г антитела на л смолы.

Фиг. 10 представляет собой фотографию разделения в полиакриламидном геле, приведенную для сравнения отличий между промежуточными продуктами выделения способа, в котором используется белок А, и способа AY-04. Наносили по 2 мкг антител для каждого образца.

На фиг. 11 представлен выход Адалимумаба после очистки на MabSelect относительно рН элюции. На фигуре продемонстрировано, что выход, по меньшей мере, 90% получали в диапазоне рН элюции, составляющем 2,5-3,8, а при рН 4 выход значительно снижался.

На фиг. 12 показаны результаты анализа сравнения выхода мономера Адалимумаба относительно рН элюции и времени инкубации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на способы выделения и очистки антител из образца культурального продукта. Один аспект изобретения направлен на снижение количества вирусов/их инактивацию в образцах, получаемых на различных стадиях очистки антител. В конкретном аспекте в способах по настоящему изобретению используется стадия кислотного снижения количества/инактивации вирусов, за которой следуют одна или более хроматографических стадий. Хроматографические стадии могут включать одну или более из следующих хроматографических процедур: ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и хроматографию гидрофобных взаимодействий. Кроме того, настоящее изобретение направлено на фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, очищенных описанным в настоящем документе способом.

Для ясности, а не для ограничения, это подробное описание было разбито на следующие разделы:

1. Определения.

2. Получение антител.

3. Продукция антител.

4. Очистка антител.

5. Способы оценки чистоты продукта.

6. Дополнительные модификации.

7. Фармацевтические композиции.

8. Применение антител.

1. Определения

Для более легкого понимания настоящего изобретения далее прежде всего приведены определения некоторых терминов.

Термин «антитело» включает молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно называемой в настоящем описании HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, Ch2, Ch3 и Ch4. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в настоящем описании LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH- и VL-области можно дополнительно разделить на гипервариабельные области, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемыми более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH- и VL-область состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных, начиная с амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин «антигенсвязывающий участок» антитела (или «участок антитела») включает фрагменты антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, hIL-12, hTNF или hIL-18). Было показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином «антигенсвязывающий участок», антитела включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, содержащий VL-, VH-, CL- и Ch2-домены; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, содержащий VH- и Ch2-домены; (iv) Fv-фрагмент, содержащий VL- и VH-домены одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки), который содержит VH-домен; и (vi) изолированную определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, их можно соединить рекомбинантными способами через синтетический линкер, что позволяет изготавливать их в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области образуют пару, давая моновалентную молекулу (известную как одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv); смотри, например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Также подразумевается, что такие одноцепочечные антитела охвачены термином «антигенсвязывающий участок» антитела. Также охвачены другие формы одноцепочечных антител, такие как диантитела. Диантитела являются бивалентными биспецифичными антителами, в которых VH- и VL-домены экспрессируются в одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким для образования пар между двумя доменами в одной цепи, таким образом, обуславливая образование пар между комплементарными доменами разных цепей и создавая два антигенсвязывающих участка (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий участок могут представлять собой часть более крупной иммуноадгезионной молекулы, образуемой ковалентными или нековалентными связями антитела или участка антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких иммуноадгезионных молекул включают использование «коровой» (связывающей биотин) области стрептавидина для создания тетрамерной scFv-молекулы (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для создания бивалентных и биотинилированных scFv-молекул (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки). Участки антител, такие как Fab- и F(ab')2-фрагменты, можно получить из полноразмерных антител, используя общепринятые методики, такие как расщепление папаином или пепсином соответственно полноразмерных антител. Более того, антитела, участки антител и иммуноадгезионные молекулы можно получить, используя стандартные методики рекомбинантных ДНК, описанные в настоящем документе. В одном аспекте антигенсвязывающие участки представляют собой полноразмерные домены или пары полноразмерных доменов.

Используемая в настоящем описании фраза «интерлейкин-12 человека» (сокращенно называемый в настоящем описании hIL-12 или IL-12) включает цитокин человека, секретируемый в основном макрофагами и дендритными клетками. Термин включает гетеродимерный белок, содержащий субъединицу 35 кДа (р35) и субъединицу 40 кДа (р40), которые соединены друг с другом дисульфидным мостиком. Гетеродимерный белок называется «субъединицей р70». Структура IL-12 человека более подробно описана, например, в Kobayashi, et al. (1989) J. Exp Med. 170:827-845; Seder, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, et al. (1995) J. Exp Med. 154:116-127; Podlaski, et al. (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки. Кодирующая IL-12 нуклеиновая кислота имеет номер доступа NM_000882 в базе данных GenBank, а полипептидная последовательность имеет номер доступа NP_000873.2 в базе данных GenBank. Подразумевается, что термин IL-12 человека включает рекомбинантный IL-12 человека (rhIL-12), который можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Используемая в настоящем описании фраза «интерлейкин-18 человека» (сокращенно называемый в настоящем описании hIL-18 или IL-18) включает цитокин человека, который исходно синтезируется в виде биологически неактивного 193-аминокислотного белка-предшественника, а также 156-аминокислотный зрелый белок, получаемый (например, а не в качестве ограничения) расщеплением белка-предшественника, например, каспазой-1 или каспазой-4, который проявляет биологическую активность, включающую костимуляцию пролиферации Т-клеток, усиление цитотоксичности NK-клеток и индукцию продукции IFN- Т-клетками и NK-клетками и усиление дифференцировки Т-хелперов 1-го типа (Th2). Кодирующая IL-18 нуклеиновая кислота имеет номер доступа NM_001562 в базе данных GenBank, а полипептидная последовательность имеет номер доступа NP_001553 в базе данных GenBank. Подразумевается, что термин IL-18 человека включает рекомбинантный IL-18 человека (rhIL-18), который можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Фраза «фактор некроза опухолей » (сокращенно называемый в настоящем описании hTNF или TNF ) относится к многофункциональному провоспалительному цитокину, секретируемому преимущественно моноцитами/макрофагами, который действует на метаболизм липидов, коагуляцию, инсулинорезистентность и функцию эндотелия. TNF представляет собой растворимый гомотример белковых субъединиц с молекулярным весом 17 кДа. Также существует мембраносвязанная форма белка-предшественника с молекулярным весом 26 кД. Он был обнаружен в синовиальных клетках и макрофагах в тканях. Другие клетки (помимо моноцитов и макрофагов) также продуцируют TNF . Например, немоноцитарные опухолевые клеточные линии человека продуцируют TNF , а также его продуцируют CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты периферической крови и некоторые культивируемые Т- и В-клеточные линии. Кодирующая TNF нуклеиновая кислота имеет номер доступа X02910 в базе данных GenBank, а полипептидная последовательность имеет номер доступа CAA26669 в базе данных GenBank. Подразумевается, что термин TNF человека включает рекомбинантный TNF человека (rhTNF ), который можно получить стандартными способами рекомбинантной экспрессии.

Термины «нумерация по Кабат», «определения по Кабат» и «разметка по Кабат» используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Эти известные в данной области термины относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными) по сравнению с другими аминокислотными остатками в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающего участка (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391; и Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Для вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельная область соответствует аминокислотам с 31-ной по 35-ную для CDR1, аминокислотам с 50-ной по 65-ную для CDR2 и аминокислотам с 95-ной по 102-ную для CDR3. Для легкой цепи гипервариабельная область соответствует аминокислотам с 24-ной по 34-ную для CDR1, аминокислотам с 50-ной по 56-ную для CDR2 и аминокислотам с 89-ной по 97-ную для CDR3.

Термин «антитело человека» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевой линии человека, описанным Kabat et al. (см. Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные в результате случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в результате соматических мутаций in vivo), например, в CDR-областях и, в частности, CDR3. Мутации можно ввести с использованием «подхода селективного мутагенеза». Антитело человека может иметь, по меньшей мере, одну замененную аминокислотную позицию, например, усиливающим активность аминокислотным остатком, который не кодируется последовательностью иммуноглобулина зародышевой линии. Антитело человека может иметь до двадцати позиций, замененных аминокислотными остатками, которые не являются частью последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека. В других вариантах осуществления изобретения заменены до десяти, до пяти, до трех или до двух позиций. В одном варианте осуществления изобретения эти замены расположены в CDR-областях. Однако используемый в настоящем описании термин «антитело человека» не предполагает включение антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, перенесены в каркасные последовательности иммуноглобулина человека.

Фраза «подход селективного мутагенеза» включает способ усиления активности антитела путем отбора и индивидуального мутагенеза аминокислот из CDR, по меньшей мере, по одной из подходящей для селективного мутагенеза позиции, позиции, по которой проходит гипермутация, и/или контактной позиции. «Селективно мутированное» антитело человека представляет собой антитело, которое содержит мутацию в позиции, выбранной с использованием подхода селективного мутагенеза. В другом аспекте предполагается, что подход селективного мутагенеза обеспечивает способ предпочтительного мутагенеза выбранных индивидуальных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (в дальнейшем h2, h3 и h4 соответственно), или CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи (в дальнейшем L1, L2 и L3 соответственно) антитела. Аминокислотные остатки могут быть выбраны из позиций для селективного мутагенеза, контактных позиций или гипермутирующих позиций. Индивидуальные аминокислоты выбирают, исходя из их позиции в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Следует понимать, что гипермутирующая позиция также может быть контактной позицией. В одном аспекте подход селективного мутагенеза представляет собой «направленный подход». Предполагается, что выражение «направленный подход» включает способ мутагенеза выбранных индивидуальных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, или CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела направленным образом, например, в виде «группового направленного подхода» или «CDR-направленного подхода». В «групповом направленном подходе» индивидуальные аминокислотные остатки в конкретных группах являются мишенями селективного мутагенеза, включая группы I (включающие L3 и h4), II (включающие h3 и L1) и III (включающие L2 и h2), группы перечислены в порядке предпочтения для мутагенеза. В «CDR-направленном подходе» индивидуальные аминокислотные остатки в конкретных CDR являются мишенями для селективного мутагенеза в следующем порядке предпочтения для мутагенеза: h4, L3, h3, L1, h2 и L2. Выбранный аминокислотный остаток заменяют, например, по меньшей мере, на два других аминокислотных остатка и определяют эффект мутации на активность антитела. Активность измеряют как изменение специфичности связывания/аффинности антитела и/или нейтрализующей способности антитела. Следует понимать, что подход селективного мутагенеза можно использовать для оптимизации любого антитела, полученного из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с зародышевыми линиями IgG человека и антитела человека, выделенные из В-клеток человека. Подход селективного мутагенеза можно использовать для антител, которые нельзя дополнительно оптимизировать с помощью методики фагового дисплея. Следует понимать, что антитела из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенные животные с зародышевыми линиями IgG человека и антитела человека, выделенные из В-клеток человека, могут быть предметом обратного мутагенеза до или после подхода селективного мутагенеза.

Фраза «рекомбинантное антитело человека» включает антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которые являются трансгенными по генам иммуноглобулинов человека (см., например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают соединение последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека (см., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NEH Publication No. 91-3242). Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (либо в случае использования трансгенных животных для последовательностей Ig человека - соматическому мутагенезу in vivo), и поэтому аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи полученными из VH- и VL-последовательностей зародышевой линии человека или связанными с ними, могут не существовать в природном репертуаре антител человека зародышевой линии in vivo. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения такие рекомбинантные антитела являются результатом селективного мутагенеза или обратного мутагенеза, либо двух этих подходов.

«Выделенное антитело» включает антитело, которое по существу свободно от других антител, имеющих другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфично связывает hIL-12, по существу свободно от антител, которые специфично связывают другие антигены, кроме hIL-12). Выделенное антитело, которое специфично связывает hIL-12, может связывать молекулы IL-12 других биологических видов. Более того, выделенное антитело может быть по существу свободным от другого клеточного материала и/или химических соединений. Подходящие антитела к IL-12, которые можно очистить в контексте настоящего изобретения, раскрыты в патенте США № 6914128 (полное содержание которого, таким образом, включено путем ссылки), в том числе, но не ограниченные этим, антитело к IL-12, обозначенное в данном патенте как J695, и которое впоследствии обозначается ABT-874. Подходящие антитела к IL-18, которые можно очистить и выделить в контексте настоящего изобретения, раскрыты в USSN 09/780035 и 10/988360, включая антитело, которое впоследствии обозначается ABT-325. Подходящим антителом к TNF является Адалимумаб (Abbott Laboratories).

«Нейтрализующее антитело» (или «антитело, которое нейтрализует активность hIL-12») включает антитело, чье связывание с hIL-12 приводит к ингибированию биологической активности hIL-12. Это ингибирование биологической активности hIL-12 можно оценить, измеряя один или более индикаторов биологической активности hIL-12, например, ингибирование индуцируемой фитогемагглютинином (ФГА) пролиферации бластных клеток человека в анализе пролиферации бластных клеток, индуцируемой ФГА, или ингибирование связывания рецептора в анализе связывания рецептора IL-12 человека. Эти индикаторы биологической активности hIL-12 можно оценить с помощью одного или нескольких стандартных in vitro или in vivo методов анализа, известных в данной области.

«Нейтрализующее антитело» (или «антитело, которое нейтрализует активность hIL-18») включает антитело, чье связывание с hIL-18 приводит к ингибированию биологической активности hIL-18. Это ингибирование биологической активности hIL-18 можно оценить, измеряя один или более индикаторов биологической активности hIL-18, например, индукцию синтеза IFN T-клетками или NK-клетками, или ингибирование связывания рецептора IL-18 в анализе связывания рецептора IL-18 человека. Эти индикаторы биологической активности hIL-18 можно оценить с помощью одного или нескольких стандартных in vitro или in vivo методов анализа, известных в данной области.

Термин «активность» включает активность, такую как специфичность связывания/аффинность антитела к антигену, например, антитела к hIL-12, связывающего антиген IL-12, и/или нейтрализующую способность антитела, например, антитела к hIL-12, чье связывание с hIL-12 ингибирует биологическую активность hIL-12, например, ингибирование индуцируемой ФГА пролиферации бластных клеток или ингибирование связывание рецептора в анализе связывания рецептора IL-12 человека. Термин «активность» включает активность, такую как специфичность связывания/аффинность антитела к IL-18 к своему антигену, например, антитела к hIL-18, связывающего антиген IL-18, и/или нейтрализующую способность антитела, например, антитела к hIL-18, чье связывание с hIL-18 ингибирует биологическую активность hIL-18. Термин «активность» также включает активность, такую как специфичность связывания/аффинность антитела к TNF антитела к своему антигену, например, антитела к TNF , связывающего антиген TNF , и/или нейтрализующую способность антитела, например, антитела к TNF , чье связывание с hTNF ингибирует биологическую активность hTNF .

Фраза «поверхностный плазмонный резонанс» включает оптическое явление, которое позволяет анализировать биоспецифические взаимодействия в режиме реального времени путем детекции изменения концентраций белков в биосенсорном носителе, например, с помощью системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ.). Дополнительное описание см. в Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., el al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; и Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277, полное содержание которых включено в настоящий документ.

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «Koff » относится к константе скорости диссоциации для диссоциации антитела из комплекса антиген/антитело.

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «Kd » относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия антиген/антитело.

Фраза «молекула нуклеиновой кислоты» включает молекулы ДНК и РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но в одном аспекте представляет собой двухцепочечную ДНК.

Фраза «выделенная молекула нуклеиновой кислоты», используемая в настоящем описании в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или участки антител (например, VH, VL, CDR3), например, антитела, которые связывают hIL-12, hTNF или hIL-18, включает молекулу нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или участок антитела, свободны от других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или участки антител, связывающих другие антигены помимо hIL-12, hTNF или hIL-18, которые могут в природе окружать нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. Таким образом, например, выделенная нуклеиновая кислота по изобретению, кодирующая VH-область антитела к IL-12h, антитела к TNF или антитела к hIL-18, не содержит других последовательностей, кодирующих другие VH-области, которые связывают другие антигены, помимо, например, IL-12, hTNF или hIL-18. Также предполагается, что фраза «выделенная молекула нуклеиновой кислоты» включает последовательности, кодирующие бивалентные, биспецифичные антитела, такие как диантитела, в которых VH- и VL-области не содержат других последовательностей, кроме последовательностей диантитела.

Фраза «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») включает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что такие термины относятся не только к конкретной клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут возникнуть некоторые модификации вследствие либо мутаций, либо воздействия окружающей среды, такое потомство может в действительности быть не идентичным родительской клетке, но оно все еще включено в объем термина «клетка-хозяин», используемый в настоящем документе.

Предполагается, что используемый в настоящем документе термин «модификация» относится к изменению одной или более аминокислот в антителах или их антигенсвязывающих участках. Изменения можно вносить добавлением, заменой или удалением аминокислот по одной или нескольким позициям. Изменения можно вносить, используя известные методики, такие как ПЦР-мутагенез.

Предполагается, что используемый в настоящем документе термин «примерно» относится к диапазону приблизительно в 10-20% выше или ниже указываемого значения. Для специалиста в данной области будет ясно, что в некоторых обстоятельствах вследствие природы указываемого значения термин «примерно» может относиться к диапазону меньше или больше 10-20%-ного отклонения от этого значения.

Предполагается, что используемая в настоящем документе фраза «снижение количества/инактивация вирусов» относится к снижению числа вирусных частиц в конкретном образце («снижение количества»), а также к снижению активности, например, но не ограниченной этим, инфицирующей способности или способности к репликации вирусных частиц в конкретном образце («инактивация»). Такое снижение количества и/или активности вирусных частиц может быть порядка от примерно 1% до примерно 99%, предпочтительно от примерно 20% до примерно 99%, более предпочтительно от примерно 30% до примерно 99%, более предпочтительно от примерно 40% до примерно 99%, еще более предпочтительно от примерно 50% до примерно 99%, еще более предпочтительно от примерно 60% до примерно 99%, еще более предпочтительно от примерно 70% до примерно 99%, еще более предпочтительно от примерно 80% до примерно 99%, и еще более предпочтительно от примерно 90% до примерно 99%. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления изобретения количество вируса (если он присутствует) в очищенном продукте антитела составляет меньше ID50 (количества вируса, которое инфицирует 50 процентов популяции-мишени) для этого вируса, предпочтительно, по меньшей мере, в 10 раз меньше ID50 для этого вируса, более предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз меньше ID50 для этого вируса и еще более предпочтительно, по меньшей мере, в 1000 раз меньше ID50 для этого вируса.

Фраза «контактная позиция» включает аминокислотную позицию в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, которая занята аминокислотой, контактирующей с антигеном в одной из двадцати шести известных структур антиген-антитело. Если аминокислота из CDR в любой из двадцати шести известных установленных структур комплексов антиген-антитело контактирует с антигеном, то можно считать, что эта аминокислота занимает контактную позицию. Контактные позиции имеют большую вероятность быть занятыми аминокислотой, которая контактирует с антигенами, чем неконтактные позиции. В одном аспекте контактная позиция представляет собой позицию из CDR, которая содержит аминокислоту, которая контактирует с антигеном в более 3 из 26 структур (>1,5%). В другом аспекте контактная позиция представляет собой позицию из CDR, которая содержит аминокислоту, которая контактирует с антигеном в более 8 из 25 структур (>32%).

2. Получение антител

Используемый в этом разделе термин «антитело» относится к интактному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.

Антитела по настоящему изобретению можно получить с помощью различных методик, включая иммунизацию животного представляющим интерес антигеном, за которой следует стандартная методика получения моноклональных антител, например, стандартная методика гибридизации соматических клеток по Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. Хотя предпочтительными являются методики гибридизации соматических клеток, в принципе можно использовать другие методики получения моноклональных антител, например, вирусную или онкогенную трансформацию лимфоцитов.

Одной предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышиная система. Получение гибридом представляет собой хорошо отработанную процедуру. Иммунизационные протоколы и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области. Партнеры для слияния (например, клетки миеломы мышей) и процедуры слияния также известны.

Предпочтительное антитело может представлять собой антитело человека, химерное или гуманизированное антитело. Химерные или гуманизированные антитела по настоящему изобретению можно получить на основе последовательности моноклонального антитела другого биологического вида, кроме человека, полученного, как описано выше. Из представляющей интерес гибридомы, полученной из клеток другого биологического вида, кроме человека, можно получить ДНК, кодирующую тяжелую и легкую цепи иммуноглобулинов, и с помощью стандартных методик молекулярной биологии ввести в нее последовательности иммуноглобулинов другого биологического вида кроме мыши (например, человека). Например, для создания химерного антитела вариабельные области иммуноглобулина мыши можно соединить с константными областями иммуноглобулина человека, используя способы, известные в данной области (см., например, патент США № 4816567 авторов Cabilly et al.). Для создания «гуманизированного» антитела CDR-области иммуноглобулина мыши можно встроить в каркасную область иммуноглобулина человека, используя способы, известные в данной области (см., например, патент США № 5225539 автора Winter и патенты США № 5530101, 5585089, 5693762 и 6180370 авторов Queen et al.).

В одном неограничивающем варианте осуществления изобретения антителами являются моноклональные антитела человека. Такие моноклональные антитела человека, направленные против IL-12, TNF или IL-18, можно получить, используя трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части иммунной системы человека вместо иммунной системы мыши. Эти трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, упоминаемых в настоящем документе как HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), KM Mouse® (Medarex, Inc.) и XenoMouse® (Amgen).

Более того, в данной области существуют альтернативные системы трансхромосомных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, и их можно использовать для получения антител по изобретению, таких как антитела к IL-12, TNF или IL-18. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому тяжелой цепи человека, так и трансхромосому легкой цепи человека, именуемых «ТХ-мыши»; такие мыши описаны в статье Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Кроме того, в данной области были описаны коровы, несущие трансхромосомы тяжелых и легких цепей человека (например, в статье Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 и РСТ-заявке № WO 2002/092812), и их можно использовать для получения антител к IL-12, к TNF или к IL-18 по этому изобретению.

Рекомбинантные антитела человека по изобретению, включающие, но не ограниченные этим, антитела к IL-12, к TNF или к IL-18 или их антигенсвязывающие участки, либо антитела, родственные антителам к IL-12, к TNF или к IL-18, раскрытые в настоящем документе, можно выделить скринингом комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител, например, библиотеки scFv-фагового дисплея, полученной с использованием кДНК VL и VH, полученных на основе мРНК из лимфоцитов человека. Методики получения и скрининга таких библиотек известны в данной области. В дополнение к доступным в продаже наборам для создания библиотек фагового дисплея (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, каталожный № 27-9400-01; и Stratagene SurfZAPTM phage display kit, каталожный № 240612, полное содержание которых включено в настоящее описание), примеры способов и реагентов, особенно подходящих для использования при создании и скрининге библиотек антител, можно найти, например, в патенте США № 5223409 авторов Ladner et al.; РСТ-публикации № WO 92/18619 авторов Kang et al.; РСТ-публикации № WO 91/17271 авторов Dower et al.; РСТ-публикации № WO 92/20791 авторов Winter et al.; РСТ-публикации № WO 92/15679 авторов Markland et al.; РСТ-публикации № WO 93/01288 авторов Breitling et al.; РСТ-публикации № WO 92/01047 авторов McCafferty et al.; РСТ-публикации № WO 92/09690 авторов Garrard et al.; статьях Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; и Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; полное содержание которых включено в настоящее описание.

Моноклональные антитела человека по этому изобретению можно также получить, используя SCID-мышей, в которых воссозданы клетки иммунной системы человека таким образом, чтобы при иммунизации можно было получить гуморальный иммунный ответ человека. Такие мыши описаны, например, в патентах США № 5476996 и 5698767 авторов Wilson et al.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы включают антитела к IL-12, к TNF или к IL-18 или их антигенсвязывающие участки, антитела и участки антител, родственные антителам к IL-12, к TNF или к IL-18, и антитела человека и участки антител со свойствами, аналогичными антителам к IL-12, к TNF или к IL-18, таким как высокоаффинное связывание с hIL-12, hTNF или hIL-18 с низкой скоростью диссоциации и высокую нейтрализующую способность. В одном аспекте изобретение относится к лечению выделенным антителом человека или его антигенсвязывающим участком, который диссоциирует с hIL-12, hTNF или hIL-18 с Kd примерно 1x10-8 M или ниже и константой скорости диссоциации Koff 1x10-3 с-1 или ниже, определенными с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В определенных неограничивающих вариантах осуществления изобретения антитело к IL-12, очищенное по изобретению, конкурентно ингибирует связывание ABT-874 с IL-12 при физиологических условиях. В определенных неограничивающих вариантах осуществления изобретения антитело к IL-18, очищенное по изобретению, конкурентно ингибирует связывание ABT-325 с IL-18 при физиологических условиях. В определенных неограничивающих вариантах осуществления изобретения антитело к TNF , очищенное по изобретению, конкурентно ингибирует связывание Адалимумаба с TNF при физиологических условиях.

В еще одном варианте осуществления изобретения антитела или их фрагменты, такие как, но не ограниченные этим, антитела к IL-12, к TNF или к IL-18 или их фрагменты, могут быть изменены, причем константная область антитела может быть модифицирована для уменьшения, по меньшей мере, одной опосредованной константной областью биологической эффекторной функции, связанной с немодифицированным антителом. Для модификации антитела по изобретению, например, для уменьшения его связывания с Fc-рецептором, сегмент константной области антитела можно мутировать в конкретных областях, необходимых для взаимодействия с Fc-рецептором (FcR) (см., например, Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; и Lund et al. (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662, полное содержание которых включено в настоящее описание). Снижение способности антитела связывать FcR также может уменьшить другие эффекторные функции, которые зависят от взаимодействия с FcR, такие как опсонизация и фагоцитоз, а также антигензависимую клеточную цитотоксичность.

3. Продукция антител

Для экспрессии антител по изобретению ДНК, кодирующую частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, встраивают в один или более экспрессионных векторов таким образом, чтобы гены были функционально соединены с последовательностями транскрипционного и трансляционного контроля. (См., например, патент США № 6914128, полное содержание которого включено в настоящий документ путем ссылки.) Предполагается, что в данном контексте термин «функционально соединенный» означает, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что последовательности транскрипционного и трансляционного контроля в векторе служат для их предполагаемой функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и контролирующие экспрессию последовательности выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встроить в отдельные векторы, или, чаще, оба гена встраивают в один экспрессионный вектор. Гены антител встраивают в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием по «тупым» концам, если сайты рестрикции отсутствуют). До встраивания последовательностей легких или тяжелых цепей антитела или родственной молекулы экспрессионный вектор может уже нести последовательности константных областей антитела. Например, одним подходом для превращения VH- и VL-последовательностей антител к IL-12, к TNF или к IL-18 или молекул, родственных антителам к IL-12, к TNF или к IL-18, в полноразмерные гены антител является встраивание их в экспрессионные векторы, которые уже кодируют константные области тяжелой и легкой цепей, соответственно, таким образом, чтобы VH-сегмент был функционально соединен с СН-сегментом (СН-сегментами) в векторе, а VL-сегмент был функционально соединен с CL-сегментом в векторе. В дополнение или в качестве альтернативы, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, что сигнальный пептид будет соединен с сохранением рамки считывания с амино-концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из белка, не относящегося к семейству иммуноглобулинов).

В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантный экспрессионный вектор по изобретению может нести одну или более регуляторных последовательностей, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Предполагается, что термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие элементы для контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в книге Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки. Для опытных специалистов в данной области будет очевидно, что конструирование экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, желаемого уровня экспрессии белка и т.д. Подходящие регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах из млекопитающих включают вирусные элементы, которые дают высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры цитомегаловируса (CMV) (такой как, CMV-промотор/энхансер), вируса обезьян 40 (SV40) (такой как SV40-промотор/энхансер), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и вируса полиомы. Для дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей, см., например, патент США № 5168062 автора Stinski, патент США № 4510245 авторов Bell et al. и патент США № 4968615 авторов Schaffner et al., полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки.

В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантный экспрессионный вектор по изобретению может нести одну или более дополнительных последовательностей, таких как последовательность, регулирующая репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки инициации репликации) и/или ген селективного маркера. Ген маркера селекции облегчает селекцию клеток-хозяев, в которых введен вектор (см., например, патенты США № 4399216, 4634665 и 5179017, все авторов Axel et al., полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Например, обычно ген маркера селекции придает устойчивость к лекарственным соединениям, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую он введен. Подходящие гены селективных маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования в dhfr- клетках-хозяевах с селекцией/амплификацией на метотрексате) и ген neo (для селекции на G418).

Антитело или участок антитела по изобретению можно получить с помощью рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетках-хозяевах. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетки-хозяева трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными экспрессионными векторами, несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, так что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетках-хозяевах и секретируются в среду, в которой культивируют клетки-хозяева, из которой можно выделить антитела. Для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, включения этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения этих векторов в клетки-хозяева используют стандартные методики рекомбинантных ДНК, такие как описанные в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и в патентах США № 4816397 и 6914128, полное содержание которых включено в настоящее описание.

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионный вектор (экспрессионные векторы), кодирующие тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина с помощью стандартных методик. Предполагается, что различные формы термина «трансфекция» охватывают широкий спектр методик, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, с помощью электропорации, кальций-фосфатного осаждения, DEAE-декстрановой трансфекции и т.п. Несмотря на то, что теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, подходящей является экспрессия антител в эукариотических клетках, таких как клетки-хозяева из млекопитающих, поскольку в таких эукариотических клетках и, в частности, клетках млекопитающих, более вероятны (по сравнению с прокариотическими клетками) сборка и секреция иммунологически активных антител с правильной укладкой. Было опубликовано, что прокариотическая экспрессия генов антител является неэффективной для получения большого выхода активного антитела (статья Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки).

Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах по настоящему изобретению являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Подходящие для этой цели прокариоты включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, энтеробактерии, такие как бактерии из рода Escherichia , например, E. coli, рода Enterobacter, Erwinia , Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, рода Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также бактерии класса Bacilli, такие как B. subtilis и B. licheniformis (например, штамм B. licheniformis 41P, раскрытый в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), рода Pseudomonas , такие как P. aeruginosa, и рода Streptomyces. Одним из подходящих для клонирования штаммов-хозяев E. coli является E. coli 294 (ATCC 31446), хотя подходят и другие штаммы, такие как E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) и E. coli W3110 (ATCC 27325). Эти примеры являются иллюстративными и не ограничивают изобретение.

Кроме прокариот в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих полипептиды, подходят эукариотические микроорганизмы, такие как филаментные грибы или дрожжи. Среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев наиболее широко используются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи. Однако для настоящего изобретения широко доступен и пригоден ряд других родов, видов и штаммов, таких как Schizosaccharomyces pombe ; клетки-хозяева рода Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans и K. мarxianus; рода Yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); рода Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; рода Schwanniomyces , такие как Schwanniomyces occidentalis; и филаментные грибы, такие как, например, рода Neurospora, Penicillium , Tolypocladium, и клетки-хозяева рода Aspergillus , такие как A. nidulans и A. niger.

Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированных антител, получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы и их варианты и соответствующие пермиссивные клетки насекомых из видов, таких как Spodoptera frugiperda (совки), Aedes aegypti (комары), Aedes albopictus (комары), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Также общедоступны разнообразные вирусные штаммы для трансфекции, например, вариант L-1 вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) Autographa californica и штамм Bm-5 ВЯП Bombyx mori, и такие вирусы можно использовать в качестве вируса по настоящему изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Также в качестве клеток-хозяев можно использовать культуры клеток растений хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петуньи, томата и табака.

Подходящие клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО) (включая dhfr- клетки CHO, описанные в статье Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220, используемые с селективным маркером DHFR, как описано в статье Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621, полное содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки), клетки миеломы NS0, клетки COS и клетки SP2. При введении рекомбинантных экспрессионных векторов, кодирующих гены антител, в клетки-хозяева млекопитающих антитела получают, культивируя клетки-хозяева в течение времени, достаточного для получения экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки. Другими примерами пригодных клеточных линий млекопитающих являются следующие линии: линия CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия почки эмбриона человека (293, или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичников китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1, ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2) (полное содержание цитируемых источников включено в настоящее описание путем ссылки).

Для получения антител клетки-хозяева трансформируют вышеописанными экспрессионными векторами или векторами для клонирования и культивируют в обычной питательной среде, модифицированной соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности.

Используемые для продукции антител клетки-хозяева можно культивировать в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят доступные в продаже среды, такие как Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM) Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma). Кроме того, в качестве культуральной среды для клеток-хозяев можно использовать любую среду, описанную в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патентах США № 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469, WO 90/03430; WO 87/00195 или патенте США Re № 30985, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки. В любую из этих сред при необходимости можно добавить гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин или фактор роста эпидермиса), соли (такие как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферы (такие как HEPES), нуклеотиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как гентамицин), микроэлементы (неорганические соединения, обычно присутствующие в конечной концентрации в микромолярном диапазоне) и глюкозу или аналогичный источник энергии. Также могут быть включены в соответствующих концентрациях любые другие необходимые добавки, которые будут известны опытным специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., соответствуют условиям, используемым для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и будут известны обычному специалисту в данной области.

Клетки-хозяева также можно использовать для получения участков интактных антител, таких как Fab-фрагменты или scFv-молекулы. Следует понимать, что вариации вышеописанной процедуры входят в объем настоящего изобретения. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения может быть целесообразно трансфицировать клетки-хозяева ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (а не обе эти цепи) антитела по изобретению. Технологию рекомбинантных ДНК также можно использовать для удаления части или всей ДНК, кодирующей любую или обе из легкой и тяжелой цепей, которая не нужна для связывания с IL-12, в частности, hIL-12, в контексте антител к IL-12, или ДНК, которая не нужна для связывания с IL-18, в частности, hIL-18, в контексте антитело к IL-18 антител, или ДНК, которая не нужна для связывания с TNF , в частности, hTNF , в контексте антител к TNF . Молекулы, экспрессирующиеся с таких укороченных молекул ДНК, также включены в антитела по изобретению. Кроме того, можно получить бифункциональные антитела (в которых одна тяжелая и одна легкая цепь являются антителом по изобретению, а другие тяжелая и легкая цепи специфичны к другому антигену, кроме IL-12, TNF или IL-18, в зависимости от специфичности антитела по изобретению) путем сшивки антитела по изобретению со вторым антителом стандартными способами химической сшивки.

В системе, подходящей для рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающего участка по изобретению, рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий как тяжелую цепь, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr-CHO кальций-фосфатной трансфекцией. В рекомбинантном экспрессионном векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функционально соединен с регуляторными элементами (CMV энхансером/AdMLP промотором) для получения высокого уровня транскрипции этих генов. Рекомбинантный экспрессионный вектор также несет ген DHFR, который позволяет селекцию клеток СНО, трансфицированных вектором с помощью селекции/амплификации на метотрексате. Отобранных трансформантов (клеток-хозяев) культивируют для получения экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела, а интактное антитело выделяют из культуральной среды. Для создания рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды используют стандартные методики молекулярной биологии.

При использовании рекомбинантных методик антитело можно получать внутри клеток, в периплазматическом пространстве или напрямую секретирующимся в среду. В одном аспекте, при внутриклеточной продукции антитела в качестве первой стадии, можно удалить твердый осадок, либо клетки-хозяева, либо лизированные клетки (например, в результате гомогенизации), например, с помощью центрифугирования или ультрафильтрации. Если антитело секретируется в среду, супернатанты из таких экспрессионных систем можно сначала концентрировать, используя доступные в продаже концентрационные фильтры, например, устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon .

До способа по изобретению процедуры очистки антител из клеточного дебриса исходно зависели от места экспрессии антитела. Некоторые антитела могут прямо секретироваться из клетки в окружающую ростовую среду; другие получают внутри клетки. В случае последних первая стадия процесса очистки обычно включает: лизис клетки, который можно осуществить различными способами, включая механическое воздействие, осмотический шок или обработку ферментами. Такое разрушение высвобождает все содержание клетки в гомогенат и, кроме того, приводит к появлению субклеточных фрагментов, которые трудно удалить вследствие их малого размера. Их обычно удаляют дифференциальным центрифугированием или фильтрацией. Если антитело секретируется, то супернатанты из таких систем экспрессии обычно сначала концентрируют, используя доступные в продаже фильтры для концентрации белков, например, системы ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon . Если антитело секретируется в среду, то рекомбинантные клетки-хозяева можно также отделить от клеточной культуральной среды, например, на тарельчатом сепараторе тангенциальной проточной фильтрацией. Антитела можно далее выделить из культуральной среды, используя способы очистки антител по изобретению.

4. Очистка антител

4.1. Общее описание очистки антител

Изобретение относится к способу получения очищенных (или с пониженным содержанием «БКХ») препаратов антител из смеси, содержащей антитело и, по меньшей мере, один БКХ. Процесс очистки по изобретению начинается со стадии разделения после продукции антитела с использованием способов, описанных выше, и способов, обычно используемых в данной области. В таблице 1 приведено краткое описание одного варианта схемы очистки. Предусмотрены вариации этой схемы, включающие, но не ограниченные этим, вариации, в которых исключена стадия аффинной хроматографии на основе белка А, или стадии ионообмена идут в обратном порядке, и они включены в объем этого изобретения.

Таблица 1

Стадии очистки и их предназначение

Стадия очисткиПредназначение
Первичное выделение Осветление образца культурального материала
Аффинная хроматографияЗахват антитела, уменьшение содержания белков клеток-хозяев и ассоциированных примесей
Катионообменная хроматография Захват антитела, снижение содержания белков клеток-хозяев и ассоциированных примесей
Ультрафильтрация/диафильтрацияКонцентрирование и смена буфера
Анионообменная хроматография Уменьшение содержания белков и ДНК клеток-хозяев
Хроматография на колонке Phenyl Sepharose HPУменьшение количества агрегатов антител и белков клеток-хозяев
Удаление вирусов фильтрациейУдаление крупных вирусов, если таковые присутствуют
Конечная ультрафильтрация/диафильтрация Концентрирование и введение антитела в фармацевтический состав

После получения осветленного раствора или смеси, содержащей полученное антитело, антитело отделяют от других белков, продуцируемых клеткой, таких как БКХ, используя комбинацию различных методик очистки, включая ионообменные стадии разделения и стадии разделения с помощью хроматографии гидрофобных взаимодействий. На стадиях разделения смеси белков разделяют, исходя из их заряда, степени гидрофобности или размера. В одном аспекте изобретения разделение проводят с помощью хроматографии, включая катионную, анионную и хроматографию гидрофобных взаимодействий. Для каждой из этих методик доступны несколько различных хроматографических смол, что позволяет точно подобрать схему очистки к конкретному белку. Идея каждого из способов разделения состоит в том, что либо белки двигаются с различной скоростью по колонке, что обеспечивает возможность их физического разделения, увеличивающегося при их продвижении по колонке, либо они селективно прикрепляются к разделяющей среде, после чего их дифференциально элюируют различными растворителями. В некоторых случаях антитело отделяют от примесей, когда примеси специфически связываются с колонкой, а антитело нет, то есть антитело присутствует в проскоке.

Как упомянуто выше, точный подбор схемы очистки основан на свойствах очищаемого белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадии разделения по настоящему изобретению используются для отделения антитела от одного или нескольких БКХ. Антитела, которые можно успешно очистить с использованием способов, описанных в настоящем документе, включают, но не ограничены этим, антитела IgA 1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG 2, IgG3, IgG4 и IgM человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения стратегии очистки по настоящему изобретению исключают использование аффинной хроматографии на основе белка А, например, в контексте очистки антител IgG 3, поскольку антитела IgG3 неэффективно связываются с белком А. Другие факторы, которые позволяют специфичный подбор схемы очистки, включают, но не ограничены этим: присутствие или отсутствие Fc-области (например, в контексте полноразмерного антитела по сравнению с его Fab-фрагментом), поскольку белок А связывается с Fc-областью; конкретные последовательности зародышевой линии, используемые при получении целевых антител; и аминокислотную композицию антитела (например, первичную последовательность антитела, а также общий заряд/гидрофобность молекулы). Имеющие одну или более таких особенностей антитела можно очищать, используя стратегии очистки, подобранные таким образом, чтобы использовать эту особенность.

4.2. Первичное выделение

Первые стадии способов очистки по настоящему изобретению включают первую фазу осветления и первичного выделения антитела из образца культурального материала. Кроме того, в процессе первичного выделения можно также снизить количество вирусов, которые присутствуют в образце культурального материала, или инактивировать их. Например, в ходе фазы первичного выделения очистки можно использовать любой один или более из ряда способов уменьшения количества/инактивации вирусов, включая температурную инактивацию (пастеризацию), рН-инактивацию, обработку растворителем/детергентом, УФ- или рентгеновское облучение и добавление некоторых химических инактивирующих агентов, таких как -пропиолактон или, например, фенантролин меди, как в патенте США № 4534972, полное содержание которого включено в настоящее описание путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в ходе фазы первичного выделения используют рН для снижения количества/инактивации вирусов в образце культурального материала.

Способы снижения количества/инактивации вирусов с помощью рН включают, но не ограничены этим, инкубацию смеси при низком рН, последующую нейтрализацию рН и удаление осадка фильтрацией. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь будет инкубироваться при рН между примерно 2-5, предпочтительно при рН между примерно 3-4 и более предпочтительно при рН примерно 3,5. рН смеси-образца можно понизить любой соответствующей кислотой, в том числе, но не ограниченной этим, лимонной кислотой, уксусной кислотой, каприловой кислотой или другими подходящими кислотами. Выбор значения рН в основном зависит от профиля стабильности антитела и буферных компонентов. Известно, что на качество целевого антитела в ходе снижения количества/инактивации вирусов с помощью низкого рН отрицательно влияют рН и длительность инкубации при низком рН. В некоторых вариантах осуществления изобретения длительность инкубации при низком рН будет составлять от 0,5 ч до 2 ч, предпочтительно от 0,5 ч до 1,5 ч и более предпочтительно длительность будет составлять 1 ч. Снижение количества/инактивация вирусов зависит от этих параметров наряду с концентрацией белка, которая может ограничивать снижение количества/инактивацию при высоких концентрациях. Поэтому для достижения желаемого уровня снижения количества/инактивации вирусов можно выбрать нужные параметры концентрации белка, рН и длительности процесса снижения количества/инактивации вирусов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения можно снизить количество вирусов/инактивировать вирусы, используя соответствующие фильтры. Неограничивающим примером подходящего фильтра является фильтр Ultipor DV50 от Pall Corporation. Хотя в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такая фильтрация используется в ходе фазы первичного выделения, в других вариантах осуществления изобретения она используется в других фазах процесса очистки, включая, например, либо предпоследнюю, либо финальную стадию очистки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для снижения количества/инактивации вирусов можно использовать альтернативные фильтры, такие как, но не ограниченные этим, фильтры Viresolve (Millipore, Billerica, Mass.); фильтры Zeta Plus VR (CUNO; Meriden, Conn.); и фильтры Planova (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, Ill.).

В этих вариантах осуществления изобретения при использовании стадии снижения количества/инактивации вирусов рН смеси-образца можно подвести, при необходимости, для дальнейшей очистки. Например, после снижения количества/инактивации вирусов с помощью низкого рН показатель рН в смеси-образце обычно подводят до более нейтральных значений, например, от примерно 4,5 до примерно 8,5 и предпочтительно до примерно 4,9 перед продолжением процесса очистки. Дополнительно смесь можно промыть водой для инъекций (WFI) для получения желаемой проводимости.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первичное выделение будет включать одну или более стадий центрифугирования для дополнительного осветления образца культурального материала, тем самым способствуя очистке антител к IL-12, к TNF или к IL-18. Образец можно центрифугировать, например, но не в качестве ограничения, при ускорении от 7000×g до приблизительно 12750×g. В контексте крупномасштабной очистки такое центрифугирование можно осуществлять в потоке со скоростью потока, установленной так, чтобы получить (для примера, а не в качестве ограничения) уровень мутности в супернатанте - 150 NTU. Такой супернатант затем можно собрать для дальнейшей очистки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первичное выделение будет включать использование одной или нескольких стадий глубинной фильтрации для дополнительного осветления образца культурального материала, тем самым способствуя очистке антител по настоящему изобретению. Глубинные фильтры содержат фильтрующий элемент, имеющий различную плотность. Такая различная плотность позволяет захватывать большие частицы около поверхности фильтра, в то время как частицы меньшего размера проходят через более крупные поры на поверхности фильтра только для того, чтобы быть захваченными в меньших порах ближе к центру фильтра. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стадия глубинной фильтрации может представлять собой стадию глубинной фильтрации с удалением липидов. Хотя в некоторых вариантах осуществления изобретения стадии глубинной фильтрации используются только в ходе фазы первичного выделения, в других вариантах осуществления изобретения глубинные фильтры, включая глубинные фильтры для удаления липидов, используются в ходе одной или нескольких дополнительных фаз очистки. Неограничивающие примеры глубинных фильтров, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают глубинные фильтры Cuno модель 30/60ZA (3M Corp.) и двухслойные фильтровальные картриджи 0,45/0,2 мкм Sartopore .

4.3. Аффинная хроматография

В некоторых вариантах осуществления изобретения образец после первичного выделения подвергается аффинной хроматографии для дальнейшей очистки представляющего интерес антитела от БКХ. В некоторых вариантах осуществления изобретения хроматографический материал способен селективно или специфически связывать интересующее антитело. Неограничивающие примеры такого хроматографического материала включают: белок А, белок G, хроматографический материал, содержащий антиген, связываемый интересующим антителом, и хроматографический материал, содержащий Fc-связывающий белок. В конкретных вариантах осуществления изобретения стадия аффинной хроматографии включает нанесение продукта после первичного выделения на колонку, содержащую подходящую смолу на основе белка А. Смола на основе белка А пригодна для аффинной очистки и выделения различных изотипов антител, в частности, IgG1, IgG2 и IgG4 . Белок А является белком клеточной стенки бактерий, который связывает иммуноглобулины млекопитающих в основном через их Fc-области. В нативном состоянии белок А имеет пять IgG-связывающих доменов, а также другие домены с неизвестной функцией.

В продаже имеется несколько вариантов смолы на основе белка А. Одной подходящей смолой является MabSelect от компании GE Healthcare. Неограничивающим примерном подходящей колонки с MabSelect является колонка диаметром примерно 1,0 см и длиной примерно 21,6 см (объем слоя составляет примерно 17 мл). Колонку этого размера можно использовать для мелкомасштабной очистки и можно проводить ее сравнение с другими колонками, используемыми для масштабирования процесса. Например, для более масштабной очистки можно использовать колонку 20×21 см с объемом слоя примерно 6,6 л. Вне зависимости от колонки в ней в качестве носителя можно использовать любую подходящую смолу, такую как MabSelect .

В некоторых вариантах осуществления изобретения предпочтительно определить динамическую обменную емкость (ДОЕ) смолы на основе белка А для подгонки способа очистки к конкретному интересующему антителу. Например, а не в качестве ограничения, ДОЕ для колонки MabSelect можно определить либо нагружением при единой скорости потока, либо нагружением при двух скоростях потока. Нагружение при единой скорости можно оценить при скорости примерно 300 см/ч в течение всего периода нагружения. Нагружение при двух скоростях потока можно определить, нагружая колонку до примерно 35 мг белка на мл смолы при линейной скорости примерно 300 см/ч, затем снижая линейную скорость наполовину, что дает более большее время удерживания для последней части нагрузки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения перед нанесением образцов колонку на основе белка А можно уравновесить подходящим буфером. Неограничивающим примером подходящего буфера является Tris/NaCl-буфер с рН примерно 7,2. Неограничивающим примером подходящих условий для уравновешивания являются 25 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH примерно 7,2. После такого уравновешивания образец можно наносить на колонку. После нагрузки колонку можно промыть один или более раз, например, буфером для уравновешивания. До проведения элюции можно выполнить другие промывки, включая промывки, в которых используются другие буферы. Например, колонку можно промыть, используя один или более объемов буфера: 20 мМ лимонная кислота/цитрат натрия, 0,5 М NaCl, pH примерно 6,0. За этой промывкой необязательно могут следовать одна или более промывок буфером для уравновешивания. Затем колонку элюируют соответствующим буфером для элюции. Неограничивающим примером подходящего элюирующего буфера является буфер, содержащий уксусную кислоту и NaCl, с pH примерно 3,5. Подходящими условиями являются, например, 0,1 М уксусная кислота, рН примерно 3,5. Состав элюата можно контролировать с помощью методик, известных опытным специалистам в данной области. Например, можно следить за поглощением при 280 нм (OD280). Элюат с колонки можно собирать, начиная с исходного отклонения примерно 0,5 AU до показаний примерно 0,5 AU в «хвосте» элюируемого пика. Представляющие интерес элюируемые фракции затем можно подготовить для дальнейшей обработки. Например, рН собранного образца можно подвести примерно до 5,0 с помощью Tris-буфера (например, 1,0 М) с рН примерно 10. Необязательно, этот продукт с подведенным рН можно отфильтровать и дополнительно обработать.

4.4. Ионообменная хроматография

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения препаратов антител с уменьшенным содержанием БКХ из смеси, содержащей антитела и, по меньшей мере, один БКХ, проводя, по меньшей мере, одну ионообменную стадию разделения смеси, для того чтобы получить элюат, содержащий антитело. Ионообменное разделение включает любой способ, с помощью которого два вещества разделяют на основе отличий их соответствующих ионных зарядов, и в нем можно использовать либо катионообменный материал, либо анионообменный материал.

Использование катионообменного материала или анионообменного материала зависит от общего заряда белка. Поэтому в объем настоящего изобретения входит использование стадии анионного обмена перед применением стадии катионного обмена или стадии катионного обмена перед применением стадии анионного обмена. Кроме того, в объем данного изобретения входит использование только стадии катионного обмена, только стадии анионного обмена или любой последовательной комбинации этих двух стадий.

При проведении разделения исходная смесь антител может контактировать с ионообменным материалом с помощью любой из ряда методик, например, методики очистки в объеме или хроматографической методики.

Например, в контексте очистки в объеме ионообменный материал приготавливают или уравновешивают желаемым стартовым буфером. После приготовления или уравновешивания получают взвесь ионообменного материала. Раствор антитела приводят в контакт с взвесью для адсорбции разделяемого антитела на ионообменном материале. Раствор, содержащий БКХ, которые не связываются с ионообменным материалом, отделяют от взвеси, например, позволяя взвеси осесть и удаляя супернатант. Взвесь можно промыть один или более раз. При желании взвесь можно промыть раствором с более высокой проводимостью для десорбции БКХ, которые связаны с ионообменным материалом. Для элюции связанных полипептидов можно увеличить концентрацию соли в буфере.

В качестве методики ионообменного разделения также можно использовать ионообменную хроматографию. В ионообменной хроматографии молекулы разделяются на основе различий между общим зарядом молекул. При очистке антитела заряд антитела должен быть противоположен заряду функциональной группы, присоединенной к ионообменному материалу, например, смоле, для их связывания. Например, антитела, которые обычно имеют общий положительный заряд в буфере с рН ниже их изоэлектрической точки, будут хорошо связываться с катионообменным материалом, который содержит отрицательно заряженные функциональные группы.

В ионообменной хроматографии заряженные участки на поверхности молекул в растворе притягиваются противоположными зарядами, прикрепленными к хроматографическому носителю, при условии низкой ионной силы окружающего буфера. Элюцию обычно осуществляют, увеличивая ионную силу буфера (например, проводимость) для конкуренции с растворенными молекулами за заряженные участки на ионообменном носителе. Изменение рН и, таким образом, изменение заряда растворенной молекулы являются другим путем элюции растворенной молекулы. Изменение проводимости или рН может быть плавным (градиентная элюция) или ступенчатым (ступенчатая элюция).

К носителям могут быть присоединены анионные или катионные заместители для образования анионных или катионных носителей для хроматографии. Неограничивающие примеры анионообменных заместителей включают диэтиламиноэтильные (DEAE), четвертичные аминоэтильные (QAE) и четвертичные амино (Q) группы. Катионные заместители включают карбоксиметильные (СМ), сульфоэтильные (SE), сульфопропильные (SP), фосфатные (P) и сульфонатные (S) группы. Целлюлозные ионообменные смолы, такие как DE23 , DE32 , DE52 , CM-23 , CM-32 и CM-52 доступны от Whatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K. Также известны ионообменники на основе SEPHADEX® и поперечно сшитые. Например, DEAE-, QAE-, CM- и SP-SEPHADEX®, и DEAE-, Q-, CM- и S-SEPHAROSE®, а также SEPHAROSE® Fast Flow, доступны от Pharmacia AB. Кроме того, оба DEAE- и CM-производные этиленгликоль-метакрилатного сополимера, такие как TOYOPEARL DEAE-650S или M и TOYOPEARL CM-650S или M доступны от Toso Haas Co., Philadelphia, Pa.

Смесь, содержащую антитело и примеси, например, БКХ, наносят на ионообменную колонку, например, катионообменную колонку. Например, а не в качестве ограничения, смесь можно нанести в количестве 80 г белка/л смолы в зависимости от используемой колонки. Примером подходящей катионообменной колонки является колонка длиной 23 см с диаметром 80 см, объем слоя которой составляет 116 л. Смесь, нанесенную на такую катионную колонку, можно далее промыть буфером для промывания (буфером для уравновешивания). Затем антитело элюируют с колонки и получают первый элюат.

Эта ионообменная стадия способствует захвату интересующего антитела, одновременно уменьшая количество примесей, таких как БКХ. В некоторых аспектах ионообменной колонкой является катионообменная колонка. Например, но не в качестве ограничения, подходящей смолой для такой катионообменной колонки является смола CM HyperDF. Эти смолы доступны в продаже, например, от Pall Corporation. Эту катионообменную процедуру можно проводить при температуре, равной или примерно равной комнатной температуре.

4.5 Ультрафильтрация/Диафильтрация

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используются стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации для дополнительной очистки и концентрации образца антитела. Ультрафильтрация подробно описана в: Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., 1996); и в: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9). Предпочтительным фильтрационным способом является тангенциальная проточная фильтрация, описанная в каталоге компании Millipore с названием «Pharmaceutical Process Filtration Catalogue», стр. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96). Обычно считается, что ультрафильтрация означает фильтрацию с использованием фильтров с размером пор меньше 0,1 мкм. В результате использования фильтров с таким маленьким размером пор объем продукта может быть уменьшен в результате прохождения буфера через фильтр, в то время как антитела остаются за фильтром.

Диафильтрация представляет собой способ, в котором используются ультрафильтры для удаления и обмена солей, сахаров и неводных растворителей, для отделения свободных частиц от связанных, для удаления низкомолекулярных соединений и/или для быстрого обмена ионного окружения и/или рН среды. Растворенные микроскопические соединения наиболее эффективно удаляются путем добавления растворителя к ультрафильтруемому раствору при скорости, приблизительно равной скорости ультрафильтрации. Этот процесс вымывает микрочастицы из раствора при постоянном объеме, эффективно очищая удерживаемое антитело. В некоторых вариантах настоящего изобретения стадии диафильтрации используют для обмена различных буферов, используемых в настоящем изобретении, необязательно, перед дальнейшими хроматографическими или другими стадиями очистки, а также для удаления примесей из препаратов антител.

4.6 Хроматография гидрофобных взаимодействий

Настоящее изобретение также включает способы получения препарата антитела со сниженным содержанием БКХ из смеси, содержащей антитело и, по меньшей мере, один БКХ, дополнительно включающие стадию разделения на основе гидрофобных взаимодействий. Например, первый элюат, полученный после ионообменной колонки, можно нанести на материал для разделения на основе гидрофобных взаимодействий, чтобы получить второй элюат, имеющий сниженное содержание БКХ. Стадии хроматографии гидрофобных взаимодействий, такие как описанные в настоящем документе, обычно проводят для удаления белковых агрегатов, таких как агрегаты антител и примесей, связанных со способом очистки.

При проведении разделения смесь-образец контактирует с материалом ХГВ, например, в объеме или на колонке. Перед ХГВ-очисткой может быть желательным удалить любые хаотропные агенты или сильно гидрофобные вещества, например, пропуская смесь через предколонку.

Например, в контексте очистки в объеме ХГВ-материал приготавливают или уравновешивают в желаемом буфере для уравновешивания. Получают взвесь ХГВ-материала. Раствор антител приводят в контракт с взвесью для адсорбции разделяемого антитела на ХГВ-материале. Раствор, содержащий БКХ, которые не связываются ХГВ-материалом, отделяют от взвеси, например, позволяя взвеси осесть и удаляя супернатант. Взвесь можно промыть один или более раз. При желании взвесь можно перевести в раствор с меньшей проводимостью для десорбции антител, связавшихся ХГВ-материалом. Для элюции связавшихся антител можно снизить концентрацию соли.

В то время как ионообменная хроматография основана на заряде антител для их выделения, в хроматографии гидрофобных взаимодействий используются гидрофобные свойства антител. Гидрофобные группы на антителе взаимодействуют с гидрофобными группами на колонке. Чем более гидрофобным является белок, тем сильнее он будет взаимодействовать с колонкой. Поэтому на ХГВ-стадии удаляются клеточные примеси (например, ДНК и другие высокомолекулярные и низкомолекулярные связанные с продуктом частицы).

Гидрофобные взаимодействия наиболее сильны при высокой ионной силе, поэтому эту форму разделения удобно проводить после осаждения солью или ионообмена. Адсорбции антитела на ХГВ-колонку способствует высокая концентрация соли, но актуальные концентрации могут варьировать в широком диапазоне в зависимости от природы антитела и конкретного выбранного ХГВ-лиганда. Различные ионы можно подобрать в так называемые солюфобные серии в зависимости от того, усиливают они гидрофобные взаимодействия (высаливающие эффекты) или разрушают структуру воды (хаотропный эффект) и приводят к ослаблению гидрофобного взаимодействия. Катионы можно выстроить в ряд по увеличению высаливающего эффекта: Ba++, Ca++, Mg++, Li+, Cs+, Na+, K+, Rb+, Nh5+; в то время как анионы можно выстроить по увеличению хаотропного эффекта: PO---, S04--, Ch4CO3 -, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN-.

Обычно сульфаты Na, K или Nh5 эффективно усиливают лиганд-белковое взаимодействие в ХГВ. Соли влияют на силу взаимодействия, как указано в следующем ряду: (Nh5 )2SO4>Na2SO4>NaCl>NH 4Cl>NaBr>NaSCN. В общем, подходит концентрация соли между 0,75 и 2М сульфата аммония или между 1 и 4М NaCl.

ХГВ-колонки обычно содержат базовый носитель (например, перекрестно-сшитую агарозу или синтетический сополимер), к которому присоединены гидрофобные лиганды (например, алкильные или арильные группы). Подходящая ХГВ-колонка содержит агарозную смолу, замещенную фенильными группами (например, колонка Phenyl Sepharose ). Многие колонки для ХГВ доступны в продаже. Примеры включают, но не ограничены этим, колонку Phenyl Sepharose 6 Fast Flow с низкой или высокой степенью замещения (Pharmacia LBCB Biotechnology, AB, Sweden); колонку Phenyl Sepharose High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); колонку Octyl Sepharose High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); колонки Fractogel EMD Propyl или Fractogel EMD Phenyl (E. Merck, Germany); носители Macro-Prep Mehyl или Macro-Prep t-Butyl (Bio-Rad, California); колонку WP HI-Propyl (C3) (J. T. Baker, New Jersey); и колонки Toyopearl ether, phenyl или butyl (TosoHaas, PA).

4.7. Примеры вариантов очистки

В некоторых вариантах осуществления изобретения первичное выделение можно осуществить последовательным снижением рН, центрифугированием и фильтрацией для удаления клеток или клеточного дебриса (включающих БКХ) из продукта, получаемого из биореактора. В качестве примера, а не в качестве ограничения, в культуре (содержащей антитела, среду и клетки) можно с помощью рН снизить количество вирусов/инактивировать вирусы, инкубируя при рН примерно 3,5 в течение приблизительно 1 часа. Показатель рН можно снизить с помощью известных препаратов кислоты, такой как лимонная кислота, например, 3 М лимонной кислоты. Инкубирование в кислом рН снижает, если полностью не элиминирует, рН-чувствительные вирусы и способствует выпадению в осадок некоторых примесей из среды/клеток. После этой стадии снижения количества/инактивации вирусов рН подводят до примерно 4,9 или 5,0, используя основание, такое как гидроксид натрия, например, 3 М гидроксид натрия, в течение от примерно двадцати до примерно 40 минут. Подведение рН можно проводить при температуре примерно 20°С. В некоторых вариантах осуществления изобретения культуру с подведенным рН затем центрифугируют при ускорении от приблизительно 7000×g до приблизительно 11000×g. В некоторых вариантах осуществления изобретения полученный супернатант образца затем пропускают через набор фильтров, содержащий ряд глубинных фильтров. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор фильтров содержит около двенадцати 16-дюймовых глубинных фильтров Cuno , модель 30/60ZA (3M Corp.) и примерно три круглых фильтровальных корпуса, заполненных 30-дюймовыми фильтровальными картриджами Sartopore 2, 0,45/0,2 мкм (Sartorius). Осветленный супернатант собирают в емкость, такую как стерильную емкость для сбора продуктов из биореактора, и хранят при температуре приблизительно 8°С. Эту температуру затем подводят до приблизительно 20°С перед стадией захватывающей хроматографии или перед описанными ниже стадиями. Следует отметить, что специалист в данной области может варьировать указанные выше условия, не выходя за рамки объема настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения за первичным выделением будет следовать аффинная хроматография на смоле на основе белка А. В продаже имеется смола на основе белка А от различных производителей. Одной подходящей смолой является MabSelect от GE Healthcare. Примером подходящей колонки с MabSelect является колонка диаметром примерно 1,0 см и длиной примерно 21,6 см (объем слоя составляет примерно 17 мл). Колонку этого размера можно использовать для экспериментального масштаба. Эту колонку можно сравнивать с другими колонками, используемыми для увеличения масштаба. Например, для коммерческого производства можно использовать колонку 20×21 см с объемом слоя, составляющим примерно 6,6 л. Вне зависимости от колонки она может содержать соответствующую смолу, такую как MabSelect .

В некоторых аспектах колонку на основе белка А можно уравновесить подходящим буфером до нанесения образцов. Примером подходящего буфера является Tris/NaCl-буфер с pH примерно 6-8, предпочтительно примерно 7,2. Конкретным примером подходящих условий являются: 25 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH 7,2. После уравновешивания продукт можно нанести на колонку. После нанесения колонку можно промыть один или более раз, используя, например, буфер для уравновешивания. Перед элюцией с колонки можно использовать другие промывки, включая промывки различными буферами. Например, колонку можно промыть, используя один или более объемов колонки, буфером (20 мМ лимонная кислота/цитрат натрия, 0,5 M NaCl, pH примерно 6,0). За этой промывкой может, необязательно, следовать одна или более промывок уравновешивающим буфером. Затем колонку на основе белка А можно элюировать, используя соответствующий буфер для элюции. Примером подходящего элюирующего буфера является буфер, содержащий уксусную кислоту и NaCl, с рН примерно 3,5. Подходящим условиями являются, например, 0,1 М уксусная кислота, рН 3,5. Элюцию можно контролировать с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. Например, можно наблюдать за поглощением при 280 нм (OD280 ). Элюат с колонки можно собирать, начиная с исходного отклонения примерно 0,5 AU до показаний примерно 0,5 AU в «хвосте» элюируемого пика. Представляющие интерес элюируемые фракции затем можно подготовить для дальнейшей обработки. Например, рН собранного продукта можно подвести до примерно 5,0 с помощью Tris-буфера (например, 1,0 М) с рН примерно 10. Необязательно, этот продукт с подведенным рН можно отфильтровать и дополнительно обработать.

Динамическую обменную емкость (ДОЕ) для колонки MabSelect можно определить либо нагружением при единой скорости потока, либо нагружением при двух скоростях потока. Нагружение при единой скорости можно оценить при скорости примерно 300 см/ч в течение всего периода нагружения. Нагружение при двух скоростях потока можно определить, нагружая колонку до примерно 35 мг белка на мл смолы при линейной скорости примерно 300 см/ч, а затем снижая линейную скорость наполовину, что дает большее время удерживания для последней части нагрузки.

Затем элюат с колонки на основе белка А можно дополнительно очистить, используя катионообменную колонку. В некоторых вариантах осуществления изобретения уравновешивающим буфером, используемым для катионообменной колонки, является буфер, имеющий рН примерно 5,0. Примером подходящего буфера является примерно 210 мМ ацетат натрия, рН 5,0. После уравновешивания на колонку наносят образец, полученный после вышеописанной стадии первичного выделения. Колонку заполняют катионообменной смолой, такой как как смола CM Sepharose Fast Flow от GE Healthcare. Затем колонку промывают буфером для уравновешивания. После чего колонку элюируют, используя буфер, имеющий большую ионную силу по сравнению с уравновешивающим буфером или промывочным буфером. Например, подходящим элюирующим буфером может быть 790 мМ ацетат натрия, рН 5,0. За элюируемыми антителами можно наблюдать с помощью УФ-спектрофотометра, контролируя поглощение при 280 нм (OD280). В конкретном примере осуществления изобретения элюат можно собирать с 3 OD280 на подъеме пика до 8 OD280 на спуске пика. Следует понимать, что специалист в данной области может варьировать условия, не выходя за рамки объема настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения элюат со смолы на основе белка А дополнительно очищают с использованием анионообменной колонки. Неограничивающим примером подходящей колонки для этой стадии является колонка диаметром 60 см и длиной 30 см, чей объем слоя составляет примерно 85 л. Колонка содержит анионообменную смолу, такую как Q Sepharose Fast Flow от GE Healthcare. Колонку можно уравновесить, используя примерно семь объемов колонки соответствующего буфера, такого как Tris/NaCl-буфер. Примером подходящих условий будут: 25 мМ Tris, 50 мМ хлорид натрия при рН 8,0. Опытный специалист в данной области может варьировать условия, не выходя за рамки объема изобретения. На колонку наносят собранный образец после стадии очистки на основе белка А, описанной выше. В другом аспекте на колонку наносят элюат, собранный после катионного обмена. После нанесения на колонку ее промывают буфером для уравновешивания (например, Tris/NaCl-буфером). Содержащий антитела проскок можно контролировать с помощью УФ-спектрофотометра, наблюдая за поглощением при 280 нм (OD280). Эта стадия анионного обмена уменьшает содержание связанных с процессом примесей, таких как нуклеиновые кислоты, например, ДНК, и белки клеток-хозяев. Разделение происходит за счет того, что целевые антитела по существу не взаимодействуют или не связываются с твердой фазой колонки, например, со смолой Q Sepharose , а многие примеси взаимодействуют и связываются с твердой фазой колонки. Анионный обмен можно проводит при температуре примерно 12°С.

В некоторых вариантах осуществления изобретения элюат после катионного обмена или анионного обмена, в зависимости от того, какая стадия осуществляется первой, затем фильтруют, используя 16-дюймовый фильтр Cuno для удаления липидов. За этой фильтрацией, в которой используется фильтр для удаления липидов, может следовать, например, 30-дюймовый двухслойный фильтровальный картридж Sartopore , 0,45/0,2 мкм. Для удаления остаточного объема, остающегося в фильтрах, и подготовки образца для ультрафильтрации/диафильтрации можно использовать элюирующий буфер для ионообмена.

Для выполнения стадии ультрафильтрации/диафильтрации приготавливают среду для фильтрации в подходящем буфере, например, 20 мМ фосфате натрия, рН 7,0. Для увеличения ионной силы можно добавить соль, такую как хлорид натрия, например, 100 мМ хлорид натрия. Эта стадия ультрафильтрации/диафильтрации служит для концентрации антител к IL-12, к TNF или к IL-18, удаления ацетата натрия и подведения рН. Фильтры для выполнения этой стадии доступны в продаже. Например, компания Millipore изготавливает кассету с целлюлозной мембраной для ультрафильтрации с порогом отсечения 30 кДа. Эту процедуру можно проводить при комнатной или приблизительно комнатной температуре.

В некоторых вариантах осуществления изобретения продукт после стадии захватывающей фильтрации подвергают второй стадии ионообменного разделения. Предпочтительно, чтобы это второе ионообменное разделение включало разделение на основе заряда, противоположного заряду первого ионообменного разделения. Например, если после первичного выделения используют анионообменную стадию, то второй ионообменной хроматографической стадией может быть стадия катионного обмена. И наоборот, если за стадией первичного выделения следует стадия катионного обмена, за этой стадией может следовать стадия анионного обмена. В некоторых вариантах осуществления изобретения элюат после первого ионообмена можно напрямую использовать во второй ионообменной хроматографической стадии, причем элюат после первого ионообмена переводят в соответствующий буфер. Подходящие материалы для анионного и катионного разделения и условия этого разделения описаны выше.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения образец, содержащий антитела, будет проходить дополнительную обработку с использованием стадии разделения на основе гидрофобных взаимодействий. Неограничивающим примером подходящей колонки для такой стадии является колонка диаметром 80 см и длиной 15 см, чей объем слоя составляет примерно 75 л, которая содержит соответствующую смолу, используемую для ХГВ, такую как, но не ограниченную этим, Phenyl HP Sepharose от Amersham Biosciences, Upsala, Sweden. Проскок, получаемый после предшествующей анионообменной хроматографической стадии, содержащий интересующие антитела, можно разбавить равным объемом буфера, содержащего примерно 1,7 М сульфат аммония, 50 мМ фосфат натрия, рН 7,0. Этот препарат можно затем профильтровать, используя двухслойный фильтр Sartopore , 0,45/0,2 мкм, или его эквивалент. В некоторых вариантах осуществления изобретения процедура гидрофобной хроматографии включает два или несколько циклов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ХГВ-колонку сначала уравновешивают подходящим буфером. Неограничивающим примером подходящего буфера является 0,85 М сульфат аммония, 50 мМ фосфат натрия, рН 7,0. Специалист в данной области может изменять буфер для уравновешивания, не выходя за рамки объема настоящего изобретения, путем изменения концентрации буферных агентов и/или заменой буфера аналогичными буферами. В некоторых вариантах осуществления изобретения на колонку затем наносят проскок после анионного обмена и промывают несколько раз, например, три раза, соответствующей буферной системой, такой как буфер, содержащий сульфат аммония и фосфат натрия. Пример подходящей буферной системы включает буфер, содержащий 1,1 М сульфат аммония, 50 мМ фосфат натрия, с рН примерно 7,0. Необязательно можно провести дополнительные циклы промывки колонки. Например, следующий промывочный цикл может включать многократную промывку колонки, например, от одного до семи раз, с использованием соответствующей буферной системы. Неограничивающий пример подходящей буферной системы включает: 0,85 мМ сульфат аммония, 50 мМ фосфат натрия, рН 7,0. В одном аспекте нагруженную колонку подвергают промывке третий раз, используя соответствующую буферную систему. Колонку можно многократно промывать, например, от одного до трех раз, используя буферную систему, такую как 1,1 М сульфат аммония, 50 мМ фосфат натрия при рН около 7,0. Кроме того, опытный специалист в данной области может варьировать буферные условия, не выходя за рамки объема настоящего изобретения.

Колонку элюируют, используя соответствующий буфер для элюции. Подходящим примером такого элюирующего буфера является 0,5 М сульфат аммония, 15 мМ фосфат натрия при рН около 7,0. Представляющие интерес антитела можно детектировать и собирать, используя обычный спектрофотометр и начиная сбор фракций с 3 OD280 на подъеме и 3 OD 280 на спуске пика.

В некоторых аспектах изобретения элюат после стадии гидрофобной хроматографии подвергают фильтрации для удаления вирусных частиц, включая интактные вирусы (при их наличии). Неограничивающим примером подходящего фильтра является фильтр Ultipor DV50 от Pall Corporation. На этой стадии фильтрации можно использовать другие фильтры для вирусов, которые хорошо известны опытным специалистам в данной области. Элюат после ХГВ пропускают через увлажненный фильтр с диаметром пор примерно 0,1 мкм и набор 2х30-дюймовых фильтров Ultipor DV50 при давлении примерно 34 фунт/кв.дюйм. В некоторых вариантах осуществления изобретения после процесса фильтрации фильтр промывают, используя, например, элюирующий буфер для ХГВ для удаления антител, оставшихся в корпусе фильтра. Фильтрат можно хранить в стерильном контейнере при температуре примерно 12°С.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фильтрат после вышеописанных стадий еще раз подвергают ультрафильтрации/диафильтрации. Эта стадия важна, если конечной целью применения изобретения на практике является использование антитела, например, в фармацевтическом составе. Этот процесс (если он применялся) может способствовать концентрации антитела, удалению ранее используемых буферных солей и замене их буфером, используемым в конкретной рецептуре. В некоторых вариантах осуществления изобретения проводят непрерывную диафильтрацию несколькими объемами, например, двумя объемами, рецептурного буфера. Неограничивающим примером подходящего рецептурного буфера является буфер, содержащий 5 мМ метионин, 2% маннит, 0,5% сахарозу, рН 5,9 (не содержащий Tween). После завершения обмена этих двух объемов антитела концентрируют. После получения определенной концентрации антитела специалист, применяющий изобретение на практике, может вычислить количество 10%-го Tween, которое необходимо добавить, чтобы получить конечную концентрацию Tween примерно 0,005% (по объему).

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения будут включать дополнительные стадии очистки. Примеры дополнительных процедур очистки, которые можно осуществить до, в течение или после ионообменной хроматографии, включают осаждение этанолом, изоэлектрическую фокусировку, обращенно-фазовую ВЭЖХ, хроматографию на силикагеле, хроматографию на гепарин-Sepharose , дополнительную анионообменную хроматографию, хроматофокусирование, электрофорез в ДСН-ПААГ, осаждение сульфатом аммония, хроматографию на гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ и аффинную хроматографию (например, с использованием белка G, антитела, специфичного субстрата, лиганда или антигена в качестве захватывающего реагента).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антителом к IL-12 является антитело изотипа IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или IgM, содержащее последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 1. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антителом к IL-12 является антитело изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, содержащее последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 1, наиболее предпочтительно антителом к IL-12 является антитело изотипа IgG1, содержащее последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антителом к TNF является антитело изотипа IgA1, IgA2 , IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 , IgG4 или IgM, содержащее последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 3. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антителом к TNF является антитело изотипа IgG1, IgG2 , IgG3 или IgG4, содержащее последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 3, наиболее предпочтительно антителом к TNF является антитело изотипа IgG1, содержащее последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, приведенные на фиг. 3.

5. Способы анализа чистоты продукта

5.1 Анализ белков клеток-хозяев

Настоящее изобретение также относится к способам определения остаточного уровня концентрации белков клеток-хозяев (БКХ) в композиции выделенного/очищенного антитела. Как указано выше, желательно исключить БКХ из конечного продукта, например, антитела к IL-12, антитела к TNF или антитела к IL-18. Примеры БКХ включают белки, источником которых является источник продукции антител. Неспособность идентифицировать и в достаточной степени удалить БКХ из целевого антитела может привести к снижению эффективности и/или неблагоприятной реакции у пациента.

Используемый в настоящем описании термин «БКХ-ELISA», в котором второе антитело, используемое в анализе специфично к БКХ, продуцируемым клетками, например, клетками СНО, используемыми для синтеза антитела (например, антитела к IL-12, к TNF или к IL-18). Второе антитело можно получить стандартными способами, известными специалистам в данной области. Например, второе антитело можно продуцировать, используя БКХ, полученные проведением «пустых» продукции и очистки, т.е. используют такую же клеточную линию, как для продукции представляющего интерес антитела, но ее не трансфицируют ДНК антитела. В примере варианта осуществления изобретения второе антитело продуцируют, используя БКХ, аналогичные белкам, которые экспрессируются в выбранной клеточной системе экспрессии, т.е. клеточной системе экспрессии, используемой для продукции целевого антитела.

В общем, БКХ-ELISA включает образование «сэндвича» из белков жидкого образца, содержащего БКХ, между двумя слоями антител, т.е. первого антитела и второго антитела. В течение инкубации продукта БКХ из него захватываются первым антителом, например, но не ограниченным этим, аффинно очищенным козьим антителом к СНО (Cygnus). Добавляют меченое второе антитело или смесь антител, специфичных к БКХ, продуцируемым клетками, используемыми для получения антител, например, биотинилированное антитело к БКХ из CHO, которое связывает БКХ в продукте. В некоторых аспектах первое и второе антитела представляют собой смеси поликлональных антител, полученных против БКХ, например, но не ограниченных этим, биотинилированные козьи антитела против смеси белков клеток-хозяев 599/626/748. Количество БКХ, содержащееся в продукте, определяют, используя соответствующий тест, основанный на метке второго антитела.

БКХ-ELISA можно использовать для определения уровня БКХ в композиции антитела, такой как элюат или проскок, полученные с использованием описанного выше способа. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей антитело, в которой композиция не содержит детектируемого уровня БКХ, определяемого с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на БКХ.

5.2 Анализ на материал аффинной хроматографии

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к способам определения остаточного уровня материала аффинной хроматографии в композиции выделенного/очищенного антитела. В некоторых случаях такой материал вымывается в композицию антитела в ходе процесса очистки. В некоторых вариантах осуществления изобретения используют анализ для определения концентрации белка А в композиции выделенного/очищенного антитела. Используемый в настоящем описании термин «белок А-ELISA» относится к ELISA, в котором второе антитело, используемое в анализе, специфично к белку А, используемому для очистки представляющего интерес антитела, например, антитела к IL-12, к TNF или к IL-18. Второе антитело можно получить стандартными способами, известными специалистам в данной области. Например, второе антитело можно продуцировать, используя природный или рекомбинантный белок А в стандартных способах получения и продукции антител.

В общем, белок А-ELISA включает образование «сэндвича» из жидкого образца, содержащего белок А (или возможно содержащего белок А), между двумя слоями антител к белку А, т.е. первого антитела к белку А и второго антитела к белку А. Образец добавляют к первому слою антител к белку А, например, но не ограниченными этим, поликлональные антитела или смесь поликлональных антител, и инкубируют в течение времени, достаточного для захвата белка А из образца первым антителом. Затем добавляют меченое второе антитело, например, но не ограниченное этим, поликлональные антитела или смесь поликлональных антител, специфичные к белку А, которые связывают захваченный белок А в образце. Дополнительные неограничивающие примеры антител к белку А, пригодные в контексте настоящего изобретения, включают куриные антитела к белку А и биотинилированные антитела к белку А. Количество белка А, содержащегося в образце, определяют, используя соответствующий тест на основе метки вторичного антитела. Аналогичные анализы можно использовать для определения концентрации других материалов аффинной хроматографии.

Белок А-ELISA можно использовать для определения уровня белка А в композиции антител, такой как элюат или проскок, полученные с использованием описанного выше способа. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей антитело, причем композиция не содержит детектируемого количества белка А, определяемого с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на белок А.

6. Дополнительные модификации

Антитела по настоящему изобретению можно модифицировать. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты химически модифицированы для получения желаемого эффекта. Например, можно провести ПЭГилирование антител или фрагментов антител по изобретению с помощью любой из реакций ПЭГилирования (присоединения молекул ПЭГ), известных в данной области, описанных, например, в следующих ссылках: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0154316 и EP 0401384, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ путем ссылки. В одном аспекте ПЭГилировние проводят с помощью реакции ацилирования или алкилирования с реакционноспособными молекулами полиэтиленгликоля (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Подходящим водорастворимым полимером для ПЭГилирования антител и фрагментов антител по изобретению является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Подразумевается, что используемый в настоящем описании термин «полиэтиленгликоль» охватывает любую из форм ПЭГ, которая использовалась для получения производных других белков, такую как моно(C1-C10)алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль.

Способ получения ПЭГилированных антител и фрагментов антител по изобретению будет в общем включать стадии: (а) реакции антитела или фрагмента антитела с полиэтиленгликолем, таким как реакционноспособное сложноэфирное или альдегидное производное ПЭГ, в подходящих условиях, в результате чего антитело или фрагмент антитела становятся присоединенными к одной или нескольким ПЭГ-группам, и (б) выделения продуктов реакции. Для среднего специалиста в данной области будет очевидно, как выбрать оптимальные условия реакции или реакций ацилирования, исходя из известных параметров и желаемого результата.

ПЭГилированные антитела и фрагменты антител, специфичные к IL-12, TNF или IL-18, обычно можно использовать для лечения связанных с IL-12, TNF или IL-18 расстройств по изобретению путем введения антител к IL-12, к TNF или к IL-18 и фрагментов антител, описанных в настоящем документе. В общем, ПЭГилированные антитела и фрагменты антител имеют увеличенное время полужизни по сравнению с немодифицированными ПЭГ антителами и фрагментами антител. ПЭГилированные антитела и фрагменты антител можно использовать по отдельности, совместно или в комбинации с другими фармацевтическими композициями.

Из антитела или участка антитела по изобретению можно получить производное или присоединить их к другой функциональной молекуле (например, другому пептиду или белку). Соответственно, предполагается, что антитела и участки антител по изобретению включают производные или иным образом модифицированные формы антител к hIL-12, к TNF или к hIL-18 человека, описанные в настоящем документе, включая молекулы иммуноадгезии. Например, антитело или участок антитела по настоящему изобретению можно функционально соединить (химической связью, генетическим слиянием, нековалентной связью или иным образом) с одной или несколькими молекулами, такими как другое антитело (например, биспецифичное антитело или диантитело), детектируемый агент, цитотоксичный агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, которые могут опосредовать связывание антитела или участка антитела с другой молекулой (такой как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка).

Один тип производных антител получают перекрестной сшивкой двух или нескольких антител (одного типа или разных типов, например, для создания биспецифичных антител). Подходящие агенты для перекрестной сшивки включают гетеробифункциональные агенты, имеющие две различных реакционноспособных группы, разделенные соответствующим спейсером (например, м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир), или гомобифункциональные агенты (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны от Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Подходящие детектируемые агенты, с помощью которых можно получить производные антитела или участка антитела по изобретению, включают флуоресцентные соединения. Примеры детектируемых флуоресцентных агентов включают флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, хлорид 5-диметиламин-1-нафталинсульфонила, фикоэритрин и т.п. Также можно получить производные антитела с детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и т.п. При получении производного антитела с детектируемым ферментом его детекцию осуществляют, добавляя дополнительные реагенты, используемые ферментом для образования детектируемого продукта реакции. Например, если детектируемым агентом является пероксидаза хрена, то добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к образованию окрашенного продукта реакции, который можно детектировать. Антитело может также образовать производное с биотином и детектироваться посредством непрямого измерения связывания с авидином или стрептавидином.

7. Фармацевтические композиции

Антитело или участок антитела по изобретению можно ввести в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту. Обычно фармацевтическая композиция содержит антитело или участок антитела по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает все возможные растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из перечисленных далее веществ: вода, солевой раствор, солевой раствор, забуференный фосфатом, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях желательно включить в композицию изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают время хранения или эффективность антитела или участка антитела.

Антитела и участки антител по изобретению можно включить в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Антитело или участки антител можно приготовить в качестве раствора для инъекций, содержащего, например, 0,1-250 мг/мл антитела. Раствор для инъекций может состоять или из жидкой, или из лиофилизированной лекарственной формы в прозрачном или темном флаконе, ампуле или предварительно заполненном шприце. Буфером может быть L-гистидин, приблизительно 1-50 мМ (оптимально, 5-10 мМ), при рН 5,0-7,0 (оптимально рН 6,0). Другие подходящие буферы включают, но не ограничены этим, сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Хлорид натрия можно использовать для модификации токсичности раствора в концентрации 0-300 мМ (оптимально 150 мМ для жидкой лекарственной формы). В лиофилизированную лекарственную форму можно включить криопротекторы, главным образом, 0-10% сахарозы (оптимально 0,5-1,0%). Другие подходящие криопротекторы включают трегалозу и лактозу. В лиофилизированную лекарственную форму можно включить наполнители, главным образом, 1-10% маннита (оптимально 24%). Как в жидкие, так и в лиофилизированные лекарственные формы можно включить стабилизаторы, главным образом, 1-50 мМ L-метионин (оптимально 5-10 мМ). Можно включить другие подходящие наполнители, в том числе глицин, аргинин, а также 0-0,05% полисорбата-80 (оптимально 0,005-0,01%). Дополнительные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничены этим, поверхностно-активные вещества полисорбат-20 и BRIJ.

В одном аспекте фармацевтическая композиция включает антитело в дозировке примерно 0,01 мг/кг-10 мг/кг. В другом аспекте дозировки антитела включают приблизительно 1 мг/кг при введении через неделю или приблизительно 0,3 мг/кг при введении каждую неделю. Опытный практикующий врач может определить корректную дозировку и схему введения субъекту.

Композиции по данному изобретению могут находиться в различных формах. Они включают, например, жидкие, мягкие и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Форма зависит от предлагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные композиции представлены в форме растворов для инъекций или инфузий, таких как композиции, аналогичные композициям, используемым для пассивной иммунизации человека другими антителами. Одним способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В одном аспекте антитело вводят внутривенной инфузией или инъекцией. В другом аспекте антитело вводят внутримышечной или подкожной инъекцией.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиции могут быть составлены в виде растворов, микроэмульсий, дисперсий, липосом или других упорядоченных структур, подходящих для высокой концентрации лекарственных соединений. Стерильные растворы для инъекций можно приготовить включением действующего вещества (т.е. антитела или участка антитела) в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним из вышеперечисленных ингредиентов или их комбинацией, как указано, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии приготавливают включением действующего вещества в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных, модифицированных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сушка распылением, дающие порошок действующего ингредиента с любым дополнительным желательным ингредиентом из его предварительного стерилизованного фильтрацией раствора. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, использованием покрытия, такого как лецитиновое покрытие, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция композиций для инъекций может быть достигнута включением в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.

Антитела и участки антител по настоящему изобретению можно вводить различными способами, известными в данной области; одним путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или инфузия. Для опытного специалиста будет ясно, что путь и/или способ введения будут варьировать в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах осуществления изобретения действующее вещество может быть приготовлено с носителем, который будет препятствовать быстрому высвобождению соединения, как, например, в препарате с контролируемым высвобождением, включающим имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких составов запатентованы и, в общем, известны специалистам в данной области. См., например, издание Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems. J.R.Robinson ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, полное содержание которого включено в настоящее описание путем ссылки.

В некоторых вариантах осуществления антитело или участок антитела по изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. Соединение (и другие ингредиенты при желании) также могут быть заключены в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, спрессованы в таблетки или введены непосредственно в пищу субъекта. Для перорального терапевтического введения соединения могут быть включены в состав с эксципиентами и использованы в форме таблеток для приема внутрь, защечных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Для введения соединения по изобретению способом, отличным от парентерального, может быть необходимо покрытие соединения оболочкой из материала, препятствующего его инактивации, или введение соединения совместно с таким материалом.

В композиции также можно ввести дополнительные действующие вещества. В некоторых вариантах осуществления антитело или участок антитела по изобретению введены в фармацевтический состав и/или вводятся совместно с одним или несколькими из дополнительных терапевтических агентов, которые используют для лечения расстройств, при которых активность IL-12, TNF или IL- 18 наносит ущерб. Например, антитело к IL-12, антитело к TNF или антитело к IL-18 или участок антитела по изобретению могут входить в фармацевтический состав и/или вводиться совместно с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связывают другие мишени (например, антителами, которые связывают другие цитокины или связывают молекулы на клеточной поверхности). Кроме того, одно или более антител по изобретению можно использовать в комбинации с одним или несколькими из вышеупомянутых терапевтических агентов. В таких способах комбинированной терапии можно предпочтительно использовать низкие дозы вводимых терапевтических агентов, таким образом, избегая возможной токсичности или осложнений, ассоциированных с различными способами монотерапии. Опытному специалисту в данной области будет ясно, что при использовании антител по изобретению, в качестве части комбинированной терапии, могут быть желательны более низкие дозировки антитела по сравнению с тем, когда субъекту вводят только одно антитело (например, в результате применения комбинированной терапии можно получить синергетический терапевтический эффект, который, в свою очередь, позволяет использование более низкой дозировки антитела для достижения желаемого терапевтического эффекта).

Следует понимать, что антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно использовать по отдельности или в комбинации с дополнительным агентом, например, терапевтическим агентом, причем указанный дополнительный агент, например, терапевтический агент, выбран опытным специалистом на основе его предполагаемой области применения. Например, дополнительный агент может быть терапевтическим агентом, который, как известно в данной области, полезен для лечения заболевания или состояния, для лечения которого используют антитело по настоящему изобретению. Дополнительный агент также может представлять собой агент, который придает полезное свойство терапевтической композиции, например, агент, который влияет на вязкость композиции.

Следует также понимать, что комбинации, которые будут включены в это изобретение, представляют собой комбинации, которые пригодны для предполагаемой области применения. Указанные ниже агенты являются иллюстративными и не ограничивают изобретение. Комбинации, которые являются частью этого изобретения, могут представлять собой антитела по настоящему изобретению и, по меньшей мере, один дополнительный агент, выбранный из приведенных ниже списков. Комбинация может также включать более одного дополнительного агента, например, два или три дополнительных агента, если комбинация составлена таким образом, что получаемая композиция может выполнять предполагаемую функцию.

Некоторыми комбинациями являются нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), которые включают лекарственные соединения, такие как ибупрофен. Другими комбинациями являются кортикостероиды, включая преднизолон; хорошо известные побочные эффекты применения стероидов можно снизить или даже устранить, снижая требуемую дозу стероидов при лечении пациентов в комбинации с антителами по этому изобретению. Неограничивающие примеры терапевтических агентов от ревматоидного артрита, с которыми можно комбинировать антитело или участок антитела по изобретению, включают следующие соединения: цитокин-супрессирующие противовоспалительные соединения (CSAID); антитела, полученные против, или антагонисты других цитокинов или факторов роста человека, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, или их лигандами, включая CD154 (gp39 или CD40L).

Некоторые комбинации терапевтических агентов могут создавать помехи на разных этапах аутоиммунного и последующего воспалительного каскада; примеры включают антагонисты TNF, такие как химерные, гуманизированные антитела к TNF или антитела человека к TNF, D2E7 (патентная заявка США с серийным номером 08/599226, поданная 9 февраля 1996 года, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки), cA2 (Remicade ), CDP 571, фрагменты антител к TNF (например, CDP870), и растворимые р55- и р75-рецепторы TNF, их производные (p75TNFRIgG (Enbrel ) или p55TNFRIgG (Lenercept)), растворимый рецептор IL-13 (sIL-13), а также ингибиторы TNF -конвертирующего фермента (TACE); аналогичным образом, ингибиторы IL-1 (например, ингибиторы интерлейкин-1-конвертирующего фермента, такие как Vx740 или IL-IRA и т.д.) могут быть эффективными по той же причине. Другие комбинации включают интерлейкин 11, антитело к P7s и гликопротеиновый лиганд р-селектина (PSGL). Другие комбинации включают других ключевых участников аутоиммунного ответа, которые могут действовать параллельно с, в зависимости от или согласовано с функцией IL-12; в частности, включая антагонисты IL-18, в том числе антитела к IL-18 или растворимые рецепторы IL-18, или IL-18-связывающие белки. Было показано, что IL-12 и IL-18 имеют перекрывающиеся, но отличающиеся функции, и комбинация антагонистов к этим двум цитокинам может быть более эффективной. Еще одна комбинация включает неистощающие ингибиторы CD4. Другие комбинации включают антагонисты костимуляторного пути CD80 (B7.1) или CD86 (B7.2), включая антитела, растворимые рецепторы или антагонистические лиганды.

Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно комбинировать с агентами, такими как метотрексат, 6-МР, азатиоприн, сульфасалазин, месалазин, олсалазина хлорохинин/гидроксихлорохин, пеницилламин, ауротиомалат (внутримышечно и перорально), азатиоприн, кохицин, кортикостероиды (перорально, ингаляцией и местные инъекции), агонисты -2-адренорецептора (сальбутамол, тербуталин, салметерол), ксантины (теофиллин, аминофиллин), кромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропиум и окситропиум, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолята мофетил, лефлуномид, НПВС, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, аденозиновые агонисты, антитромботические средства, ингибиторы системы комплемента, адренергетики, агенты, препятствующие прохождению сигнала от провоспалительных цитокинов, таких как TNF или IL-1 (например, ингибиторы IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP киназы), ингибиторы IL-l -конвертирующего фермента (например, Vx740), антитело к P7s, гликопротеиновый лиганд р-селектина (PSGL), ингибиторы TNF -конвертирующего фермента (TACE), ингибиторы Т-клеточных сигнальных путей, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые р55- и р75-рецепторы TNF и их производные p75TNFRIgG (Enbrel ) и p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, растворимый рецептор IL-13 (sIL-13)) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGF ). Другие комбинации включают метотрексат или лефлуномид и в случае ревматоидного артрита средней тяжести или тяжелого - циклоспорин.

Неограничивающие примеры терапевтических агентов против воспалительных заболеваний кишечника, с которыми можно комбинировать антитела или участки антител по изобретению, включают следующие соединения: буденозид, фактор роста эпидермиса, кортикостероиды, циклоспорин, сульфасалазин, аминосалицилаты, 6-меркаптопурин, азатиоприн, метронидазол, ингибиторы липоксигеназы, месаламин, олсалазин, балсалазид, антиоксиданты, ингибиторы тромбоксана, антагонисты рецептора IL-1, моноклональные антитела к IL-1 , моноклональные антитела к IL-6, факторы роста, ингибиторы эластазы, пиридинил-имидазольные соединения, антитела, полученные против, или антагонисты других цитокинов или факторов роста человека, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90, или их лигандами. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки также можно комбинировать с агентами, такими как метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолята мофетил, лефлуномид, НПВС, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, аденозиновые агонисты, антитромботические средства, ингибиторы системы комплемента, адренергетики, агенты, препятствующие прохождению сигнала от провоспалительных цитокинов, таких как TNF или IL-1 (например, ингибиторы IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP киназы), ингибиторы IL-l -конвертирующего фермента (например, Vx740), антитело к P7s, гликопротеиновый лиганд р-селектина (PSGL), ингибиторы TNF -конвертирующего фермента, ингибиторы Т-клеточных сигнальных путей, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые р55- и р75-рецепторы TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, растворимый рецептор IL-13 (sIL-13)) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGF ).

Примеры терапевтических агентов против болезни Крона, с которыми можно комбинировать антитело или антигенсвязывающий участок, включают следующие соединения: антагонисты TNF, например, антитела к TNF, D2E7 (патентная заявка США с серийным номером 08/599226, поданная 9 февраля 1996 года, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки), cA2 (Remicade ), CDP 571, фрагменты антител к TNF (например, CDP870), конструкции TNFR-Ig (p75TNFRIgG (Enbrel ) и p55TNFRIgG (Lenercept)), антитело к P7s, гликопротеиновый лиганд р-селектина (PSGL), растворимый рецептор IL-13 (sIL-13) и ингибиторы PDE4. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно комбинировать с кортикостероидами, например, буденозидом и дексаметазоном. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки также можно комбинировать с агентами, такими как сульфосалазин, 5-аминосалициловая кислота и олсалазин, и агентами, которые нарушают синтез или действие провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, например, ингибиторы IL-1-конвертирующего фермента (например, Vx740) и IL-1ra. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно также использовать с ингибиторами Т-клеточных сигнальных путей, например, ингибиторами тирозиновых киназ, 6-меркаптопуринами. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно комбинировать с IL-11.

Неограничивающие примеры терапевтических агентов против рассеянного склероза, с которыми можно комбинировать антитела или участки антител по изобретению, включают следующие соединения: кортикостероиды, преднизолон, метилпреднизолон, азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, метотрексат, 4-аминопиридин, тизанидин, IFN 1a (Avonex; Biogen), IFN 1b (Betaseron; Chiron/Berlex), Сополимер 1 (Сор-1; Copaxone; Teva Pharmaceutical Industries Inc.), гипербарический кислород, иммуноглобулин для внутривенного введения, кладрибин, антитела, полученные против или антагонисты других цитокинов или факторов роста человека, например, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90, или их лигандами. Антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки также можно комбинировать с агентами, такими как метотрексат, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолята мофетил, лефлуномид, НПВС, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, аденозиновые агонисты, антитромботические средства, ингибиторы системы комплемента, адренергетики, агенты, препятствующие прохождению сигнала от провоспалительных цитокинов, таких как TNF или IL-1 (например, ингибиторы IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP киназы), ингибиторы IL-l -конвертирующего фермента (например, Vx740), антитело к P7s, гликопротеиновый лиганд р-селектина (PSGL), ингибиторы TACE, ингибиторы Т-клеточных сигнальных путей, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента, растворимые рецепторы цитокинов и их производные (например, растворимые р55- и р75-рецепторы TNF, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, растворимый рецептор IL-13 (sIL-13)) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGF ).

Примеры терапевтических агентов против рассеянного склероза, с которыми можно комбинировать антитела или их антигенсвязывающие участки, включают IFN , например, IFN la и IFN 1b, копаксон, кортикостероиды, ингибиторы IL-1, ингибиторы TNF и антитела к лиганду CD40 и CD80.

Фармацевтические композиции по изобретению могут включать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или участка антитела по изобретению. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или участка антитела может варьировать в соответствии с факторами, такими как состояние болезни, возраст, пол и вес субъекта, а также способность антитела или участка антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или участка антитела перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу используют у субъектов до заболевания или на ранней его стадии, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.

Схемы приема лекарственного средства можно подбирать для получения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно вводить одну дозу болюсом, можно вводить несколько дробных доз в течение периода времени или дозу можно пропорционально снижать или повышать в зависимости от нужд терапевтической ситуации. В некоторых вариантах осуществления изобретения особенно предпочтительно составление парентеральных композиций в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и однообразия дозировки. Используемый в настоящем описании термин стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов-млекопитающих, получающих лечение; каждая единица содержит определенное количество действующего соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Характеристики стандартных лекарственных форм по изобретению диктуются и прямо зависят от (а) уникальных характеристик действующего соединения и определенного терапевтического или профилактического эффекта, который предполагается получить, и (б) ограничений, присущих способу изготовления лекарственных форм такого действующего соединения для лечения чувствительности у субъектов.

Примерный неограничивающий интервал для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или участка антитела по изобретению составляет 0,1-20 мг/кг, или 1-10 мг/кг, или 0,3-1 мг/кг. Следует отметить, что дозировка может варьировать в зависимости от типа и остроты состояния, требующего лечения. Кроме того, следует понимать, что для любого определенного субъекта конкретные схемы приема должны подбираться с течением времени в соответствии с нуждами субъекта и профессиональным суждением специалиста, который осуществляет введение или руководит введением композиций, и что приведенные в настоящем описании диапазоны дозировок являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или применения заявленной композиции.

8. Применение антител по изобретению

8.1 Общие варианты применения антитела к IL-12

Вследствие своей способности связывать IL-12, антитела к IL-12 или их участки по изобретению можно использовать для детекции IL-12, в одном аспекте - hIL-12 (например, в образце культурального материала, в одном аспекте, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма), с помощью стандартного иммуноаналитического метода, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимический анализ ткани. Изобретение относится к способу детекции IL-12 в биологическом образце, включающему контактирование образца с антителом или участком антитела по изобретению и детекцию либо антитела (или участка антитела), связанного с IL-12, либо несвязанного антитела (или участка антитела), для детекции таким путем IL-12 в образце. Антитело прямо или непрямо метят детектируемым веществом для облегчения детекции связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинофлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; а примеры подходящих радиоактивных материалов включают 125I, 131I, 35S или 3H. Детекция IL-12 может применяться в диагностике, например, в диагностике состояний, ассоциированных с увеличенным уровнем IL-12, и/или может применяться для идентификации субъекта, в отношении которого лечение антителом к IL-12 может оказать благоприятный эффект.

В качестве альтернативы мечению антитела анализ IL-12 в образце можно осуществлять с помощью конкурентного иммуноанализа, в котором используют стандарты rhIL-12, меченные детектируемым веществом, и немеченые антитела против IL-12, такие как антитело к hIL-12. В данном анализе объединяют образец, меченые стандарты rhIL-12 и антитело к hIL-12 и определяют количество меченого стандарта rhIL-12, связанного с немеченым антителом. Количество hIL-12 в образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта rhIL-12, связанного с антителом к hIL-12.

Антитела или участки антител по изобретению способны нейтрализовать активность IL-12 in vitro и in vivo, в одном аспекте активность hIL-12. Соответственно, антитела или участки антител по изобретению можно использовать для ингибирования активности IL-12, например, в культуре клеток, содержащей hIL-12, y человека или других млекопитающих, имеющих IL-12, с которыми антитела по изобретению имеют перекрестную реактивность (например, приматов, таких как павиан, яванский макак и макак резус). В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу человека или его антигенсвязывающему участку, которое нейтрализует активность IL-12 человека и, по меньшей мере, одного дополнительного IL-12 приматов, выбранных из группы, состоящей из IL-12 павиана, IL-12 игрунки, IL-12 шимпанзе, IL-12 яванского макака и IL-12 макака резус, но не нейтрализует активность IL-12 мыши. В одном аспекте IL-12 представляет собой IL-12 человека. Например, антитело или участок антитела по изобретению можно добавить в культуральную среду в культуре клеток, содержащих или предположительно содержащих IL-12, для ингибирования активности IL-12 в культуре.

В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования активности IL-12 y субъекта, страдающего от расстройства, при котором активность IL-12 наносит ущерб. IL-12 вовлечен в патофизиологию широкого спектра расстройств (Windhagen et al, (1995) J. Exp. Med. 182:1985-1996; Morita et al. (1998) Arthritis and Rheumatism. 41:306-314; Bucht et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 103:347-367; Fais et al. (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Pyrronchi et al., (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology. 112:1169-1178; и Berrebi et al., (1998) Am. J. Path 152:667-672; Pyrronchi et al. (1997) Am. J. Path. 150:823-832; полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Изобретение относится к способам ингибирования активности IL-12 у субъекта, страдающего от такого расстройства, причем способ включает введение субъекту антитела или участка антитела по изобретению, так что ингибируется активность IL-12 у субъекта. В одном аспекте IL-12 представляет собой IL-12 человека, а субъектом является человек. В качестве альтернативы субъектом может быть млекопитающее, имеющее экспрессию IL-12, с которым антитело по изобретению перекрестно реактивно. Помимо того, субъект может представлять собой млекопитающее с введенным hIL-12 (например, в результате введения hIL-12 или экспрессии трансгенного hIL-12). Антитело по изобретению можно вводить человеку для терапевтических целей. Более того, антитело по изобретению можно вводить млекопитающему животному, имеющему экспрессию IL-12, с которым антитело перекрестно реактивно, для ветеринарных целей или как животной модели болезни человека. Относительно последнего такие животные модели можно использовать для оценки терапевтической эффективности антител по изобретению (например, для тестирования доз и динамики при введении).

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «расстройство, при котором активность IL-12 наносит ущерб», включает заболевания и другие расстройства, для которых было показано, что присутствие IL-12 у субъекта, страдающего от расстройства, отвечает или предположительно отвечает за патофизиологию расстройства или является фактором, усугубляющим расстройство. Соответственно, расстройство, при котором активность IL-12 наносит ущерб, представляет собой расстройство, при котором ожидается, что ингибирование активности IL-12 уменьшает симптомы и/или замедляет развитие расстройства. Такие расстройства могут быть обнаружены, например, по повышению концентрации IL-12 в биологической жидкости субъекта, страдающего от расстройства (например, по повышению концентрации IL-12 в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.п. субъекта), которое можно определить, например, с помощью антитела к IL-12, как описано выше. Существует множество примеров расстройств, при которых активность IL-12 наносит ущерб. В одном аспекте антитела или их антигенсвязывающие участки можно использовать в терапии для лечения заболеваний или расстройств, описанных в настоящем документе. В другом аспекте антитела или их антигенсвязывающие участки можно использовать для изготовления лекарственного препарата для лечения заболеваний или расстройств, описанных в настоящем документе. Применение антител и участков антител по изобретению в лечении нескольких неограничивающих конкретных расстройств ниже обсуждается более подробно.

Интерлейкин 12 играет критическую роль в патологии, ассоциированной с рядом заболеваний, включающих иммунные и воспалительные элементы. Эти заболевания включают, но не ограничены этим, ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный артрит, артрит Лайма, псориатический артрит, реактивный артрит, спондилоартропатию, системный волчаночный эритематоз, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, инсулинозависимый сахарный диабет, тироидит, астму, аллергические заболевания, псориаз, дерматит склеродермы, атопический дерматит, болезнь «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантата органов, острое или хроническое иммунное заболевание, ассоциированное с трансплантацией органов, саркоидоз, атеросклероз, диссеминированную внутрисосудистую коагуляцию, болезнь Кавасаки, болезнь Грейва, нефротический синдром, синдром хронической усталости, гранулематоз Вегенера, пурпуру Геноха-Шенлейна, микроваскулит почек, хронический активный гепатит, увеит, септический шок, синдром токсического шока, септический синдром, кахексию, инфекционные заболевания, паразитарные заболевания, синдром приобретенного иммунодефицита, острый поперечный миелит, хорею Хантингтона, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, инсульт, первичный билиарный цирроз, гемолитическую анемию, злокачественные новообразования, сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, болезнь Аддисона, спорадическую полигландулярную недостаточность I типа и полигландулярную недостаточность II типа, синдром Шмидта, синдром (острой) дыхательной недостаточности у взрослых, алопецию, гнездовую алопецию, серонегативную артропатию, артропатию, болезнь Рейтера, псориатическую артропатию, артропатию при язвенном колите, энтеропатический синовит, артропатию, ассоциированную с хламидиозом, иерсиниозом и сальмонеллезом, спондилоартропатию, атероматозную болезнь/атеросклероз, атопическую аллергию, аутоиммунное буллезное заболевание, обыкновенную пузырчатку, эксфолиативную пузырчатку, пемфигоид, линейный IgA зависимый буллезный дерматоз, аутоиммунную гемолитическую анемию, гемолитическую анемию с положительной реакцией Кумбса, приобретенную пернициозную анемию, ювенильную пернициозную анемию, миалгический энцефалит/синдром хронической усталости, хронический мукокожный кандидоз, гигантоклеточный артериит, первичный склерозирующий гепатит, криптогенный аутоиммунный гепатит, синдром приобретенного иммунодефицита, заболевания, связанные с приобретенным иммунодефицитом, гепатит С, общий вариабельный иммунодефицит (общую вариабельную гипогаммаглобулинемию), дилатационную кардиомиопатию, женское бесплодие, угасание функции яичников, преждевременное угасание функции яичников, фиброз легких, криптогенный фиброзный альвеолит, поствоспалительную интерстициальную болезнь легких, интерстициальную пневмонию, интерстициальную болезнь легких, ассоциированную с заболеванием соединительной ткани, болезнь легких, ассоциированную со смешанным заболеванием соединительной ткани, интерстициальную болезнь легких, ассоциированную с системным склерозом, интерстициальную болезнь легких, ассоциированную с ревматоидным артритом, болезнь легких, ассоциированную с системным волчаночным эритематозом, болезнь легких, ассоциированную с дерматомиозитом/полимиозитом, болезнь легких, ассоциированную с болезнью Шегрена, болезнь легких, ассоциированную с анкилозирующим спондилитом, диффузную болезнь легких при васкулите, болезнь легких, ассоциированную с гемосидерозом, интерстициальную болезнь легких, вызываемую лекарственными соединениями, радиационный фиброз, облитерирующий бронхиолит, хроническую эозинофильную пневмонию, лимфоцитарную инфильтрирующую болезнь легких, постинфекционную интерстициальную болезнь легких, подагрический артрит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный гепатит 1-го типа (классический аутоиммунный или волчаночный гепатит), аутоиммунный гепатит 2-го типа (гепатит с антителами к печеночно-почечным микросомам (LKM)), аутоиммунную гипогликемию, инсулинорезистентность типа В с acanthosis nigricans , гипопаратироидизм, острое иммунологическое заболевание, ассоциированное с трансплантацией органов, хроническое иммунологическое заболевание, ассоциированное с трансплантацией органов, остеоартроз, первичный склерозирующий холангит, идиопатическую лейкопению, аутоиммунную нейтропению, болезнь почек NOS, гломерулонефрит, микроваскулит почек, болезнь Лайма, дискоидный волчаночный эритематоз, мужское бесплодие, идиопатическое или NOS, аутоиммунную реакцию на сперму, рассеянный склероз (все подтипы), инсулинозависимый сахарный диабет, симпатическую офтальмию, легочную гипертонию, вторичную к заболеванию соединительной ткани, синдром Гудпасчера, легочную манифестацию узелкового полиартериита, острую ревматическую лихорадку, ревматоидный спондилит, болезнь Стилла, системный склероз, болезнь Такаясу/артериит, аутоиммунную тромбоцитопению, идиопатическую тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, гипертиреоидизм, аутоиммунный тиреоидит (болезнь Хашимото), атрофический аутоиммунный гипотиреоидизм, первичную микседему, факогенный увеит, первичный васкулит и витилиго. Антитела человека и участки антител по изобретению можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности, ассоциированных с воспалением, включая ревматоидный спондилит, аллергию, аутоиммунный диабет и аутоиммунный увеит.

В некоторых аспектах антитела по изобретению или их антигенсвязывающие участки используют для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона, рассеянного склероза, инсулинозависимого сахарного диабета и псориаза.

8.2 Применение антител к IL-12 при ревматоидном артрите

Предполагается, что интерлейкин-12 играет роль в воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит. У пациентов с ревматоидным артритом в синовии детектируется индуцируемая мРНК IL-12p40, и было показано, что IL-12 присутствует в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (смотри, например, Morita et al, (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки). Было найдено, что IL-12-положительные клетки присутствуют в подлежащем слое синовия пациентов с ревматоидным артритом. Антитела человека и участки антител по изобретению можно использовать для лечения, например, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, артрита Лайма, ревматоидного спондилита, остеоартрита и подагрического артрита. Обычно антитело или участок антитела вводят системно, хотя в случае некоторых расстройств может быть выгодно местное введение антитела или участка антитела. Антитело или участок антитела по изобретению также можно вводить совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, пригодными для лечения аутоиммунных заболеваний.

В случае мышиной модели ревматоидного артрита, индуцируемого коллагеном артрита (CIA), лечение мышей антителами к IL-12 (крысиными моноклональными антителами к мышиному IL-12, C17.15) до артрита значительно подавляло его возникновение и снижало частоту возникновения и тяжесть протекания заболевания. Лечение моноклональными антителами к IL-12 после начала артрита снижало тяжесть его течения, но более позднее лечение мышей моноклональными антителами к IL-12 после начала заболевания оказывало минимальный эффект на тяжесть заболевания.

8.3 Применение антител к IL-12 при болезни Крона

Интерлейкин-12 также играет роль в воспалительной болезни кишечника, болезни Крона. Повышенная экспрессия IFN- и IL-12 наблюдается в слизистой кишечника пациентов с болезнью Крона (см., например, Fais et al., (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Pyrronchi et al., (1997) Amer. J. Pathol. 150:823-832; Monteleone et al., (1997) Gastroenterology 112:1169-1178; Berrebi et al., (1998) Amer. J. Pathol. 152:667-672, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Было показано, что антитела к IL-12 подавляют заболевание в мышиной модели колита, например, индуцируемого TNBS колита у мышей, нокаутных по IL-2, и недавно это было показано для мышей, нокаутных по IL-10. Соответственно, антитела и участки антител по изобретению можно использовать для лечения воспалительных болезней кишечника.

8.4 Применение антител к IL-12 при рассеянном склерозе

Интерлейкин-12 является ключевым медиатором при рассеянном склерозе. Экспрессию индуцируемой мРНК IL-12p40 или самого IL-12 можно наблюдать в очагах склероза у пациентов с рассеянным склерозом (Windhagen et al., (1995) J. Exp. Med 182:1985-1996, Drulovic et al., (1997) J. Neurol. Sci. 147:145-150, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). Хронические пациенты с прогрессирующим рассеянным склерозом имеют повышенный уровень IL-12 в кровотоке. Исследования Т-клеток и антигенпредставляющих клеток (АРС) у пациентов с рассеянным склерозом выявили самоподдерживающиеся серии иммунных реакций в качестве причины прогрессирующего рассеянного склероза, приводящей к иммунному ответу Th2-типа. Повышенная секреция IFN- из Т-клеток приводит к увеличению продукции IL-12 антигенпредставляющими клетками, который поддерживает цикл, приводя к хронической активации Th2-типа иммунного ответа и заболеванию (Balashov et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:599-603, полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки). Роль IL-12 в рассеянном склерозе исследовали с использованием экспериментальных моделей рассеянного склероза на мышах и крысах (аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) мышей и крыс). В возвратно-ремиттирующей ЕАЕ-модели множественного склероза у мышей предварительное лечение моноклональными антителами к IL-12 откладывало паралич и улучшало клинические показатели. Лечение моноклональными антителами к IL-12 на пике паралича или в течение последующего периода ремиссии улучшало клинические показатели. Соответственно, антитела или их антигенсвязывающие участки по изобретению могут служить для ослабления симптомов, ассоциированных с рассеянным склерозом, у людей.

8.5 Применение антител к IL-12 при инсулинозависимом сахарном диабете

Интерлейкин-12 вовлечен в качестве важного медиатора инсулинозависимого сахарного диабета (ИЗСД). ИЗСД индуцировали у NOD-мышей (диабетических без ожирения) путем введения IL-12, а антитела к IL-12 служили защитой в адоптивной трансферной модели ИЗСД. При начале ИЗСД у пациентов часто наблюдается так называемый «период медового месяца» (клиническая ремиссия), в течение которого сохраняется функция некоторых остаточных островковых клеток. Эти остаточные островковые клетки продуцируют инсулин и регулируют уровень глюкозы в крови лучше вводимого инсулина. Лечение таких пациентов на ранней стадии диабета с помощью антитела к IL-12 может предупредить дальнейшее разрушение островковых клеток, таким образом сохраняя эндогенный источник инсулина.

8.6 Применение антител к IL-12 при псориазе

Интерлейкин-12 является ключевым медиатором псориаза. Псориаз представляет собой острое и хроническое поражение кожи, которое ассоциировано с Th2-типом профиля экспрессии цитокинов. (Hamid et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225-231; Turka et al. (1995) Mol. Med. 1690-699, полное содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). мРНК IL-12p35 и IL-12p40 детектировали в образцах кожи людей, больных псориазом. Соответственно, антитела или их антигенсвязывающие участки по изобретению могут служить для лечения хронических заболеваний кожи, таких как псориаз.

8.7 Общие варианты применения антител к IL-18

Благодаря их способности связывать IL-18, антитела к IL-18 или их участки по изобретению можно использовать для детекции IL-18, в одном аспекте - hIL-18 (например, в образце культурального материала, в одном аспекте, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма), с помощью стандартного иммуноаналитического метода, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимический анализ ткани. Изобретение относится к способу детекции IL-18 в биологическом образце, включающему контактирование образца с антителом или участком антитела по изобретению и детекцию либо антитела (или участка антитела), связанного с IL-18, либо несвязанного антитела (или участка антитела), для детекции таким путем IL-18 в образце. Антитело прямо или непрямо метят детектируемым веществом для облегчения детекции связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламинофлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; а примеры подходящих радиоактивных материалов включают 125I, 131I, 35S или 3H. Детекция IL-18 может быть полезна в диагностике, например, для диагностики состояний, ассоциированных с увеличенным уровнем IL-18, и/или может быть полезной для идентификации субъекта, на которого лечение антителом к IL-18 может оказать благоприятный эффект.

В качестве альтернативы мечению антитела анализ IL-18 в образце можно осуществлять с помощью конкурентного иммуноанализа, в котором используют стандарты rhIL-18, меченные детектируемым веществом, и немеченые антитела к IL-18, такие как антитело к hIL-18. В данном анализе объединяют образец, меченые стандарты rhIL-18 и антитело к hIL-18 и определяют количество меченого стандарта rhIL-18, связанного с немеченым антителом. Количество hIL-18 в образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта rhIL-18, связанного с антителом к hIL-18.

Антитела или участки антител по изобретению способны нейтрализовать активность IL-18 in vitro и in vivo, в одном аспекте активность hIL-18. Соответственно, антитела или участки антител по изобретению можно использовать для ингибирования активности IL-18, например, в культуре клеток, содержащей hIL-18, y человека или других млекопитающих, имеющих IL-18, с которыми антитела по изобретению имеют перекрестную реактивность (например, приматов, таких как павиан, яванский макак и макак резус). В одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу человека или его антигенсвязывающему участку, которое нейтрализует активность IL-18 человека и, по меньшей мере, одного дополнительного IL-18 приматов, выбранных из группы, состоящей из IL-18 павиана, IL-18 игрунки, IL-18 шимпанзе, IL-18 яванского макака и IL-18 макака резус, но не нейтрализует активность IL-18 мыши. В одном аспекте IL-18 представляет собой IL-18 человека. Например, антитело или участок антитела по изобретению можно добавить в культуральную среду культуры клеток, содержащих или предположительно содержащих IL-18, для ингибирования активности IL-18 в культуре.

В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования активности IL-18 y субъекта, страдающего от расстройства, при котором активность IL-18 наносит ущерб. Интерлейкин 18 играет критическую роль в патологии, ассоциированной с множеством заболеваний, включающих иммунные и воспалительные элементы.

Предполагается, что используемый в настоящем описании термин «расстройство, при котором активность IL-18 наносит ущерб» включает заболевания и другие расстройства, для которых было показано, что присутствие IL-18 у субъекта, страдающего от расстройства, отвечает или предположительно отвечает за патофизиологию расстройства, или является фактором, усугубляющим расстройство. Соответственно, расстройство, при котором активность IL-18 наносит ущерб, представляет собой расстройство, при котором ожидается, что ингибирование активности IL-18 уменьшает симптомы и/или замедляет развитие расстройства. Такие расстройства могут быть обнаружены, например, по повышению концентрации IL-18 в биологической жидкости субъекта, страдающего от расстройства (например, по повышению концентрации IL-18 в сыворотке, плазме, синовиальной жидкости и т.п. субъекта), которое можно определить, например, с помощью антитела к IL-18, как описано выше. Существует множество примеров расстройств, при которых активность IL-18 наносит ущерб. В одном аспекте антитела или их антигенсвязывающие участки можно использовать в терапии для лечения заболеваний или расстройств, описанных в настоящем документе. В другом аспекте антитела или их антигенсвязывающие участки можно использовать для изготовления лекарственного препарата для лечения заболеваний или расстройств, описанных в настоящем документе. Применение антител и участков антител по изобретению в лечении нескольких неограничивающих конкретных расстройств обсуждается более подробно ниже.

Изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения заболеваний или состояний, которые требуют модулирования активности IL-18. Эти заболевания или состояния включают аутоиммунные заболевания, диабет I типа, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, воспалительное заболевание кишечника, сепсис, рассеянный склероз, ишемическую болезнь сердца (включая сердечные приступы), ишемическое поражение мозга, хронический гепатит, псориаз, хронический панкреатит, острый панкреатит и т.п.

Соответственно, целесообразно использовать антитела к IL-18, или их антигенсвязывающие участки, или векторы, экспрессирующие их in vivo, для лечения аутоиммунных заболеваний, диабета I типа, ревматоидного артрита, отторжения трансплантата, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, рассеянного склероза, ишемической болезни сердца (включая сердечные приступы), ишемического поражения мозга, хронического гепатита, псориаза, хронического панкреатита, острого панкреатита и аналогичных заболеваний, которые отличаются нарушенной экспрессией IL-18, приводящей к избытку IL-18, или в случае осложнений вследствие экзогенно введенного IL-18.

8.8 Применение антител к IL-18 при поражении печени

Один аспект настоящего изобретения относится к новым средствам лечения и/или предупреждения поражения печени. Было найдено, что ингибитор IL-18 является эффективным для предупреждения и лечения поражений печени. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора IL-18 для изготовления лекарственного препарата для лечения и/или предупреждения поражения печени. Более конкретно изобретение относится к лечению и/или предупреждению поражений печени, вызванных алкогольным гепатитом, вирусным гепатитом, иммунным гепатитом, фульминантным гепатитом, циррозом печени и первичным билиарным циррозом.

8.9 Применение антител к IL-18 при артрите

Также по настоящему изобретению было найдено, что ингибитор IL-18 эффективен в терапии артрита. Терапевтический эффект включает снижение тяжести течения заболевания, а также предупреждение распространения заболевания. Поэтому изобретение относится к использованию ингибитора IL-18 для лечения и/или предупреждения артрита. Это открытие было неожиданным, поскольку из приведенного выше состояния уровня техники нельзя было заключить, что блокировка одного конкретного фактора, вовлеченного в артрит, а именно интерлейкина 18, приведет к ослаблению артрита или даже к излечению пораженного артритом сустава.

Термин «артрит» включает все различные типы артрита и артритических состояний, как острого, так и хронического артрита, определенных, например, на посвященной артриту странице в интернете кафедры ортопедии Университета Вашингтона. Примерами артритических состояний являются анкилозирующий спондилит, боль в спине, синдром карпального канала, синдром Элерса-Данлоса, подагра, ювенильный артрит, волчаночный эритематоз, миозит, неполный остеогенез, остеопороз, полиартериит, полимиозит, псориатический артрит, синдром Рейтера, склеродермия, артрит с заболеванием кишечника, болезнь Бехчета, детский артрит, дегенеративное заболевание суставов, фибромиалгия, инфекционный артрит, болезнь Лайма, синдром Марфана, остеоартрит, остеонекроз, болезнь Пагета, ревматическая полимиалгия, псевдоподагра, рефлекторная симпатическая дистрофия, ревматоидный артрит, ревматизм, синдром Шегрена, семейный аденоматозный полипоз и т.п.

Ревматоидный артрит вызывает воспаление выстилки суставов (синовиальной мембраны, одноклеточного слоя эпителия) и/или внутренних органов. Болезнь сохраняется в течение многих лет, обычно затрагивая ряд различных суставов по всему телу и в итоге вызывая поражение хряща, костей, сухожилий и связок. Суставами, которые могут быть затронуты ревматоидным артритом, являются, например, суставы, расположенные в шее, плечах, локтях, бедрах, запястьях, руках, коленях, щиколотках и ступнях. Во многих случаях при ревматоидном артрите воспаляются симметричные суставы.

Ревматоидный артрит встречается у примерно 1% из популяции в Соединенных Штатах, будучи распространенным среди всех этнических групп и возрастов. Во всем мире число женщин с ревматоидным артритом превышает число мужчин в три раза.

Было найдено, что введение ингибитора IL-18 значительно снижает эрозию хряща в мышиной модели артрита. Поэтому настоящее изобретение также относится к использованию ингибитора IL-18 в изготовлении лекарственного препарата для лечения и/или предупреждения разрушения хряща.

8.10 Общие варианты применения антитела к TNF антител

Фактор некроза опухолей- представляет собой многофункциональный провоспалительный цитокин, секретируемый в основном моноцитами/макрофагами, который оказывает эффект на липидный метаболизм, коагуляцию, инсулинорезистентность и функции эндотелия. TNF является растворимым гомотримером белковых субъединиц весом 17 кДа. Также существует мембранносвязанный предшественних TNF с молекулярным весом 26 кДа. Он обнаруживается в синовиальных клетках и макрофагах в тканях. Клетки помимо моноцитов или макрофагов также продуцируют TNF . Например немоноцитарные опухолевые клеточные линии человека продуцируют TNF , а также CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты периферической крови и некоторые культивируемые Т- и В-клеточные линии продуцируют TNF . Он вовлечен в развитие ревматоидного артрита (но не только его) и появляется при многих воспалительных заболеваниях. Рецепторы TNF присутствуют на нескольких мононуклеарных клетках, в синовиальной мембране, а также на клетках периферической крови и в синовиальной жидкости. TNF представляет собой критический воспалительный медиатор при ревматоидном артрите и поэтому может являться подходящей мишенью для специфичной иммунотерапии.

TNF вызывает провоспалительное действие, которое приводит к поражению тканей, такому как разрушение хряща и кости, индукция молекул адгезии, индукция прокоагулирующей активности клеток васкулярного эндотелия, усиление прикрепления нейтрофилов и лимфоцитов и стимуляция высвобождения фактора активации тромбоцитов макрофагами, нейтрофилами и клетками васкулярного эндотелия. По последним данным TNF ассоциирован с инфекциями, иммунологическими расстройствами, неопластическими патологиями, аутоиммунными патологиями и патологиями, связанными с реакцией «трансплантат против хозяина».

Полагают, что TNF играет центральную роль в сепсисе и эндотоксиновом шоке, вызываемом грамотрицательными бактериями, включая лихорадку, недомогание, анорексию и кахексию. Эндотоксин сильно активирует продукцию и секрецию TNF и других цитокинов моноцитами/макрофагами. TNF и другие моноцитарные цитокины опосредуют метаболические и нейрогормональные ответы на эндотоксин. Введение эндотоксина добровольцам приводило к острому заболеванию с гриппоподобными симптомами, включая лихорадку, тахикардию, ускорение метаболизма и высвобождение стрессовых гормонов. TNF повышен в кровотоке у пациентов, страдающих от сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями.

Таким образом, TNF вовлечен в воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, вирусные, бактериальные и паразитарные инфекции, злокачественные новообразования и/или нейродегенеративные заболевания и представляет собой подходящую мишень для специфической биологической терапии при заболеваниях, таких как ревматоидный артрит и болезнь Крона. Были опубликованы благоприятные эффекты при открытых исследованиях с химерным моноклональным антителом к TNF совместно с подавлением воспаления и с успешным повторным лечением после возврата ревматоидного артрита и болезни Крона.

Было показано, что у млекопитающих нейтрализующая антисыворотка или моноклональные антитела к TNF отменяют негативные физиологические изменения и предупреждают смертельный исход после летального воздействия в экспериментальной эндотоксемии и бактеремии. Адалимумаб (также известный под своей торговой маркой, HUMIRA®, доступной от Abbott Laboratories) представляет собой рекомбинантное моноклональное антитело человека, специфичное к TNF . Это моноклональное антитело связывает TNF и блокирует его взаимодействие с p55 и p75 рецепторами TNF на клеточной поверхности. Это моноклональное антитело весьма специфично к TNF и, по-видимому, не ингибирует активность TNF . В присутствии системы комплемента Ализирует поверхность клеток, экспрессирующих TNF .

ПРИМЕРЫ

1. Выделение и очистка антител к IL-12

1.1 Стратегия очистки

После завершения продукции антител к IL-12 в культуре клеток рН среды медленно подводили до 3,5 и оставляли при таком рН в течение 1 часа, затем рН подводили до 5 и центрифугировали (при 11000×g) для удаления клеток и осажденных примесей. Супернатант после центрифугирования дополнительно осветляли на двухступенчатом наборе фильтров Cuno 90ZA с последующей фильтрацией через фильтр 0,45/0,2 мкм). После осветления осуществляли захват и дополнительную очистку антитела в процедуре из пяти стадий.

Перед хроматографией рН осветленного подкисленного клеточного культурального продукта титровали до 7 с помощью 3 н. NaOH в течение 30 минут и фильтровали.

Для экспериментального масштаба использовали колонку диаметром примерно 1,0 см и длиной примерно 21,6 см (объем слоя составляет примерно 17 мл). Колонку диаметром примерно 1,0 см и длиной примерно 15,1 см (объем слоя составляет примерно 11,9 мл) использовали ранее для получения материала для разработки системы очистки высокой степени. Колонку диаметром примерно 20 см и длиной примерно 21 см (объем слоя составляет примерно 6,6 л) использовали для объема продукта 300 л. Колонки набивали смолой MabSelect (GE Healthcare, кат. № 17-5199-04, № партии 302070); измеряли асимметрию пика и высоту, эквивалентную теоретической тарелке (ВЭТТ), для определения качества набивки колонки.

Колонку уравновешивали буфером: 25 мМ Tris, 100 мМ NaCl, pH 7,2. После уравновешивания на колонку наносили осветленный клеточный культуральный продукт (v=300 см/ч для начального нанесения до 35 г антитела на л смолы, затем 150 см/ч до конца нанесения, 40 г/л максимум). Затем колонку промывали 3 объемами колонки (CV) буфера для уравновешивания (v=300 см/ч), затем 3 CV буфера (20 мМ лимонной кислоты/цитрата натрия, 0,5 M NaCl, pH 6), после чего промывали дополнительными 3 CV буфера для уравновешивания. Продукт элюировали 0,1 М уксусной кислоты, 100 мМ NaCl, pH 3,5 (v=300 см/ч). Элюат с колонки собирали, начиная с первоначального подъема до 0,1 AU при А280 до 0,1 AU в выходящем хвосте элюируемого пика (проточная кювета с длиной оптического пути 2 мм), и немедленно титровали до рН 5 буфером 1,0 M Tris, pH 10.

Динамическую обменную емкость (ДОЕ) для колонки MabSelect можно определить либо нагружением при единой скорости потока, либо нагружением при двух скоростях потока. Нагружение при единой скорости оценивали при скорости примерно 300 см/ч в течение всего периода нагружения. Нагружение при двух скоростях потока проводили, нагружая колонку до примерно 35 мг белка на мл смолы при линейной скорости примерно 300 см/ч, затем снижая линейную скорость наполовину, что дает более большее время удерживания для последней части нагрузки. В каждом эксперименте колонку перегружали для гарантии насыщения колонки в данных условиях нагрузки. Проскок для каждого прогона фракционировали для того, чтобы определить общее количество нагруженного антитела до момента детекции 5% антитела в проскоке. Титры фракций проскока (FT) были получены ВЭЖХ-анализом на колонке Poros A .

Для элюируемых образцов выход вычисляли с помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм (коэффициент экстинкции составляет 1,42 для раствора 1 мг/мл с использованием кюветы с длиной оптического пути 1 см). Титры нагрузки определяли ВЭЖХ-анализом на колонке Poros A . Для оценки чистоты, степени удаления БКХ и вымываемого белка А проводили эксклюзионную ВЭЖХ, БКХ-ELISA и на основе белка A ELISA.

Элюат после смолы MabSelect титровали до pH 8±0,1 с помощью Tris-буфера, 1 M, pH 10 и затем разводили водой до 6,5±0,5 мСм/см. Разведенный материал перемешивали в течение одного часа, а затем фильтровали через фильтр для удаления липидов (Cuno ) и фильтр 0,45/0,2 мкм.

Для проточной хроматографии на колонке Q Sepharose в экспериментальном масштабе использовали колонку диаметром примерно 1,0 см и длиной примерно 29 см (объем слоя - 22,8 мл). Колонку диаметром примерно 20 см и длиной примерно 29,5 см (объем слоя составляет 9,27 л) использовали для масштаба 300 л. Колонки набивали смолой Q Sepharose FF (GE Healthcare, кат. № 17-0510-04, № партии 296307 для масштаба 300 л, № партии 303189 для экспериментального масштаба); измеряли асимметрию пика и ВЭТТ для определения качества набивки колонки.

Смолу уравновешивали буфером 25 мМ Tris, 50 мМ NaCl, pH 8. Хроматографию проводили в режиме проскока, при котором примеси адсорбируются на смоле, а антитела проходят сквозь колонку. Нанесение на колонку проводили на скорости 150 см/ч, а сбор проскока (FTW) начинали, когда A280 превышала 0,2 AU. Образцы FTW отбирались через интервалы, соответствующие нанесению 30, 50, 80, 90 и 100 г белка на л смолы. Затем колонку промывали буфером для уравновешивания и продолжали сбор FTW до возвращения A280 до оптической плотности (OD) 0,2 AU. FTW после колонки Q Sepharose немедленно разбавляли равным объемом 1,7 M (Nh5 )2SO4, 50 мМ фосфата натрия, pH 7 (SR-343) для подготовки к нанесению на колонку Phenyl Sepharose HP. Этот раствор фильтровали через фильтр 0,2 мкм и маркировали «нанос на колонку Phenyl Sepharose HP».

Выход вычисляли с помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм (коэффициент экстинкции составляет 1,42 для раствора 1 мг/мл с использованием кюветы с длиной оптического пути 1 см). Для оценки чистоты, степени удаления БКХ и вымываемого белка А проводили эксклюзионную ВЭЖХ, БКХ-ELISA и ELISA на основе белка А.

Для высокоэффективной хроматографии на колонке Phenyl Sepharose HP в экспериментальном масштабе использовали колонку диаметром примерно 1,0 см и длиной примерно 15,6 см (объем слоя - 12,3 мл). Колонку диаметром примерно 20 см и длиной примерно 15,5 см (объем слоя составляет 4,87 л) использовали для масштаба 300 л. Колонки набивали смолой Phenyl Sepharose HP (GE Healthcare, Piscatway, NJ, кат. № 17-1082-04, № партии 298138); измеряли асимметрию пика и ВЭТТ для определения качества набивки колонки.

Смолу уравновешивали в 25 мМ фосфата натрия, 0,85 M сульфата аммония, pH 7. Максимальная нагрузка по белку на этой стадии была 40 г белка на литр смолы (v=75 см/ч). После наноса колонку промывали 3 объемами колонки 20 мМ фосфата натрия, 1,1 M (NH 4)2SO4, pH 7 (SR-290). Продукт элюировали ступенчатым градиентом, используя 15 мМ фосфата натрия, pH 7, 0,5 M сульфата аммония при линейной скорости 37,5 см/ч. Элюат с колонки собирали, начиная с первоначального подъема до 0,1 AU при А280 до 0,2 AU в выходящем хвосте элюируемого пика. Агрегаты и другие примеси оставались связанными на смоле и удалялись с ХГВ-колонки промыванием водой или 0,5 М NaOH.

Выход вычисляли с помощью УФ-спектрофотометрии при 280 нм (коэффициент экстинкции составляет 1,42 для раствора 1 мг/мл с использованием кюветы с длиной оптического пути 1 см). Для оценки чистоты, степени удаления БКХ и вымываемого белка А проводили эксклюзионную ВЭЖХ, БКХ-ELISA и ELISA на основе белка А.

Удаление вирусов фильтрацией через фильтр Ultipor DV20 не оценивали ни в случае экспериментального масштаба, ни в случае масштабирования в лабораторных условиях, вследствие ограничений по размеру. Вместо этого фильтр Ultipor DV50 использовали в масштабе продукта 300 л для получения материала для доклинических исследований. В экспериментальном масштабе продукт, элюируемый после хроматографии на колонке Phenyl Sepharose HP, использовали напрямую в финальной операции ультрафильтрации и диафильтрации.

На этой стадии UF/DF использовали регенерируемый целлюлозный ультрафильтр с порогом отсечения (MWCO) 30 кДа от компании Millipore. Перед проведением операции систему ультрафильтрации обеззараживали 1 М NaOH и промывали водой.

Фильтрат после DV50 сначала концентрировали до 30 мг белка/мл. Проводили непрерывную диафильтрацию 2 объемами (DV) 5 мМ гистидина, 5 мМ метионина, 0,5% сахарозы, 2% (масс./об) маннита, pH 5,9 (буфер для диафильтрации) (SR-265). Концентрат дополнительно концентрировали до 40 г/л, затем диафильтровали дополнительными 6 DV буфера для диафильтрации. Концентрат дополнительно концентрировали до 75 г/л. Затем продукт удаляли из системы ультрафильтрации и промывали ее буфером для диафильтрации для сбора продукта, удерживаемого системой. Объединяли концентрат и смыв, получая диафильтрованный продукт антитела с концентрацией примерно 65 г/л. Этот продукт после фильтрации через фильтр 0,2 мкм был готов для финальной фасовки по флаконам.

1.2 Анализ чистоты продукта

Эксклюзионная ВЭЖХ. Чистоту антител оценивали с помощью эксклюзионной хроматографии, эксклюзионной ВЭЖХ.

ВЭЖХ-анализ на колонке Poros A. Титры антител культурального продукта, наноса на MabSelect и образцов фракций проскока определяли количественным захватывающим анализом на колонке Poros A .

БКХ-ELISA. Уровень белков клеток-хозяев оценивали с помощью ELISA на белки клеток-хозяев. Получали сэндвич БКХ между двумя специфичными антителами в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA).

Планшет покрывали по 100 мкл/лунку смеси аффинно-очищенных козьих антител к клеткам СНО (по 6 мкг/мл каждого в 50 мМ бикарбоната натрия, pH 9,4) в течение 1 часа при 37°С и качании 80 об./мин; затем выливали содержимое планшета и блокировали неспецифические сайты раствором казеина (300 мкг/лунка) в течение 1 часа при 37°С и качании 80 об./мин. После блокирования планшет промывали буфером для промывания (1X PBS, 0,1% Triton X-100, pH 9). Образцы для построения стандартной кривой приготавливали серийными разведениями аликвоты с концентрацией 5,2 мг/мл белков клеток-хозяев СНО. Разбавителем для всех реагентов является казеин, нагретый до 37°С и обработанный ультразвуком в течение 2 мин, если не указано иное. Концентрации для стандартной кривой составляли 300, 200, 133, 89, 59, 40, 26 и 18 нг/мл. Стандарт антител разбавляли в 5 раз и использовали в анализе в качестве контроля. Для того чтобы результаты анализа считались принятыми, вычисленное значение для контроля должно находится в диапазоне 45-76 нг БКХ/мл. Образцы разводили таким образом, чтобы вычисленные значения попадали в диапазон стандартной кривой. Стандарты, контроль и образцы наносили на планшет в дупликатах (100 мкл/лунку). Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа при качании 80 об./мин. После инкубации образцов планшет промывали буфером и наносили по 100 мкл/лунку биотинилированных козьих антител к клеткам СНО, разведенных до 3 мкг/мл. Планшет инкубировали при 37°С и качании 80 об./мин в течение 1 часа, а затем промывали. Добавляли по 100 мкл/лунку конъюгата нейтравидина с пероксидазой хрена (HRP) и планшет инкубировали при 37°С и качании 80 об./мин в течение 1 часа. Проводили финальную промывку и проявляли планшет, добавляя по 100 мкл/лунку колориметрического субстрата для HRP, K Blue, на 7 минут при качании на 3-й скорости на качалке для микротитровочных планшетов от компании Lab-line при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением по 100 мкл/лунку 2 М фосфорной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм. Интенсивность цвета была пропорциональна количеству БКХ, присутствующих в тестируемом образце.

Белок A-ELISA. Освобождение от белка А оценивали, используя аналитический набор от компании Cygnus Technologies, Inc. (набор для иммуноферментного анализа для измерения белка А в образцах, содержащих иммуноглобулин человека, кат. № F050H). Стандарты, реагенты и планшеты были предоставлены в наборе. Образцы разводили до 1 мг/мл в 1Х PBS и денатурировали при 100°С в течение 5 минут в денатурирующем буфере (50 мкл денатурирующего буфера на 200 мкл образца). Образцы центрифугировали при 6000×g в течение 5 минут для того, чтобы осадить денатурированное антитело. Во все лунки добавляли по 100 мкл биотинилированных антител к белку А и 50 мкл супернатанта из денатурированных образцов, контролей и стандартов. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и качании при 180 об/мин. Содержимое лунок отсасывали и планшет промывали вручную четыре раза по 300 мкл промывочного раствора. В каждую лунку добавляли конъюгат стрептавидина и щелочной фосфатазы (100 мкл) и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа при комнатной температуре и качании при 180 об./мин. После промывания планшета, как описано выше, в лунки добавляли по 100 мкл колориметрического субстрата щелочной фосфатазы и планшет инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре и качании при 180 об/мин. Измеряли поглощение при 405 и 492 нм. Если поглощение для образца 16 нг/мл было

www.freepatent.ru

Стыдливое мракобесие

?

scinquisitor (scinquisitor) wrote, 2018-04-14 01:50:00 scinquisitor scinquisitor 2018-04-14 01:50:00 Category: «Анаферон детский» — один из множества препаратов компании «Материа Медика», который можно купить без рецепта в любой аптеке. Уверен, что читатель слышал об этом средстве от простуды, гриппа и других острых респираторных заболеваний, а может, даже лечился им.В описании этого «лекарства» сказано, что в его состав входят активные компоненты — «антитела к гамма интерферону человека аффинно очищенные — 0,003 г». Далее мелким шрифтом: «активная форма с содержанием не более 10-16 (десять в минус шестнадцатой) нг/г действующего вещества». Нанограмм — это одна миллиардная доля грамма, и если перемножить все эти числа и учесть массу таблетки, то окажется, что в ней не должно быть и одной молекулы каких-либо антител к интерферону или иного действующего вещества. За 200 рублей обеспокоенный родитель покупает своему ребенку 20 таблеток, состоящих из вспомогательных веществ: лактозы моногидрата (0,267 г), целлюлозы микрокристаллической (0,03 г) и магния стеарата (0,003 г). Иными словами, вы приобретаете молочный сахар по цене 37 400 рублей за килограммСвои препараты компания называет «релиз-активными». Продаются они исключительно в России (и ряде стран СНГ), Мексике, Монголии и Вьетнаме. Причем только россияне тратят на них несколько миллиардов рублей в год. Кто-то решит, что если бы препараты не работали, они бы не пользовались такой популярностью! Но это очень легко объяснить.В то время как добросовестным производителям лекарств нужно искать новые действующие вещества, производить их и проводить дорогостоящие клинические исследования, у торговцев сахаром лишь одна существенная статья расходов — на рекламу. Поэтому похвалу препаратам «Материи Медики» можно встретить повсюду: от газет до центральных телеканалов. Теперь представим, что кто-то поверит такой рекламе и начнет лечить сахаром грипп или простуду. В большинстве случаев болезнь пройдет сама (как в анекдоте: с лечением простуда проходит за неделю, без лечения за семь дней). В таком случае пациент может ошибочно предположить, что препарат ему помог. Он ведь не знает, что и без чудесного лекарства поправился бы столь же быстро. Поэтому какие-то люди продолжат лечиться «Анафероном», искренне уверенные, что препарат им помогает. Ну, а голоса тех, кто все же не смог победить болезнь, мы и не услышим.

Из-за сложной динамики самочувствия при многих заболеваниях человеку очень трудно понять, какое средство работает, а какое нет. Особенно если он основывается исключительно на личном опыте. Поясню на примере, который я использовал в книге «Защита от темных искусств»:

«В 2011 году в журнале The New England Journal of Medicine вышла статья, где сравнивалась эффективность четырех подходов для лечения астмы: бронхорасширяющего препарата „Сальбутамол“, плацебо-ингаляции, имитации акупунктуры и отсутствия лечения. Каждого пациента лечили с помощью всех четырех подходов по отдельности, в случайном порядке. Объективные данные спирометрии (объемные и скоростные показатели дыхания) показали, что лекарство помогает, тогда как остальные три подхода одинаково неэффективны. Однако, по субъективным ощущениям пациентов, все три метода активной терапии помогли одинаково хорошо по сравнению с полным отсутствием лечения».Поэтому и нужны тщательно спланированные клинические исследования с участием большого количества пациентов, чтобы понять, какие лекарства работают, а какие — нет.

Разумеется, компаний, торгующих пустышками и использующих вышеупомянутую неосведомленность граждан, очень много. И было бы странно выделять одну лишь «Материю Медику». Желающие могут ознакомиться со списком популярных препаратов, не имеющих доказанной эффективности. Но возмущение ученых связано не только с введением в заблуждение пациентов, но и с тем, что их компания-производитель пытается продвигать сомнительные исследования «релиз-активности» и выдавать их за науку.

Больше всего «научных» статей, посвященных релиз-активным препаратам «Материи Медики», опубликовано в отечественном журнале, входящем в список ВАК — «Бюллетене экспериментальной биологии и медицины». Директор компании, член-корреспондент Российской академии наук Олег Эпштейн в 2003 году стал автором 49 статей (!) в этом журнале. Все они вышли под обложкой специального выпуска, редактором которого тоже был Эпштейн. Вскоре он защитил докторскую.

Подробную критику феномена «релиз-активности» можно почитать в статье Никиты Хромова-Борисова и Михаила Архипова «Вызов Эпштейна». В международных рецензируемых научных журналах тоже была опубликована критика некоторых работ Эпштейна, например, наша совместная статья с медицинским химиком Евгенией Дуевой в Journal of Medical Virology. Но сегодня я ограничусь лишь несколькими цитатами из статьи Олега Эпштейна «Феномен релиз-активности и гипотеза „пространственного“ гомеостаза», которые, наверно, шокируют любого биолога. Для остальных поясню, что ниже последует абсолютно бессмысленное сочетание реальных и выдуманных терминов.

«…Мы считаем, что геном не порождает новую физическую сущность — „поле“, а интегрирует организм в супрамолекулярный „эфир“, что обеспечивает структурную основу целостной регуляции организма». «Генетическим кодом любого индивидуума является не просто первичная последовательность нуклеотидов, а их уникальная целостная (голографическая) пространственная организация, обладающая собственным набором тонких — супрамолекулярных — колебательных характеристик». «Передаваемая из поколения в поколение ДНК способна в своей колебательной структуре сохранять общевидовые пространственные параметры и, по сути, обеспечивает „подключение“ будущего организма к эволюционно сложившейся на супрамолекулярном уровне общевидовой пространственной матрице».

Чем-то это напоминает рассуждения другого известного деятеля лженауки — Петра Гаряева, автора концепции «волнового генома», распространяющего идеи, что мат разрушает ДНК. Увы, как было показано в статье психолога Гордона Пенникока и его коллег из университета Ватерлоо «О восприятии и распознавании псевдоглубокой брехни», люди легко принимают наукообразные бессодержательные рассуждения (полученные хоть при помощи генератора случайных цитат) за нечто разумное. На это, видимо, и расчет.

На своем сайте «Материа Медика» заявляет о наличии тридцати завершенных клинических исследований. Под теми же названиями, что и в Государственном реестре лекарственных средств, 20 из них зарегистрированы на американском сайте clinicaltrials.gov. Девять из них признаны завершенными, но только для одного их них представлены результаты. Тому, что для остальных завершенных исследований результаты не представлены, может быть два объяснения. Либо эти результаты не прошли надлежащий контроль качества и не удовлетворили независимых экспертов, либо авторы захотели скрыть результаты от регулятора.

В завершенном исследовании с представленными результатами утверждается лишь, что эффективность «Эргоферона» (другого противовирусного «релиз-активного» препарата «Материи Медики») сопоставима с эффективностью «Осельтамивира» (он же «Тамифлю»). Но это едва ли говорит об эффективности «Эргоферона». Дело в том, что «Осельтамивир» недавно был понижен в списке жизненно важных препаратов по версии Всемирной организации здравоохранения до категории «вспомогательные препараты». Оказалось, что исходно производитель предоставил не все данные исследований, а только часть — тем самым значительно завысив эффективность препарата. Размер выборки, использованной в исследовании «Материи Медики», невелик, поэтому оно могло бы выявить только очень большие отличия между «Эргофероном» и «Тамифлю», а их может и не быть в силу того, что «Тамифлю» если и лучше сахара, то ненамного. Кроме того, экспериментаторы и пациенты знали, кто какой препарат получает, а значит, исследование не было слепым и чистым.

Искаженная подача данных о клинических исследованиях — типичный прием производителей лекарств на основе сахара. Процитирую сайт компании «Буарон», производящей «Оциллококцинум»:«На сайте общества доказательной медицины Cochrane можно обнаружить слепые рандомизированные плацебоконтролируемые исследования по ряду гомеопатических препаратов, демонстрирующие положительные результаты. В частности, Оциллококцинум там фигурирует с метанализом шести РКИ (рандомизированных контролируемых исследований), являясь одним из всего лишь 5 упоминаемых противопростудных лекарств (помимо Ремантадина, Амантадина, Занамивира и Осельтамивира)».

Но если не полениться и открыть упомянутый метаанализ на сайте Cochrane, то можно прочитать следующее:

«В целом, представление результатов исследования было недостаточным, и поэтому многие аспекты методов испытаний и результаты имели неясный риск смещения. В связи с этим мы оценили качество этих свидетельств/доказательств, в целом, как низкое, поэтому сделать четкие выводы в отношении применения Оциллококцинума для профилактики или лечения гриппа и гриппоподобных заболеваниях не представляется возможным».Тут надо пояснить, что «Оциллококцинум» по составу — это тоже сахар, которым торгуют под видом лекарства от гриппа и простуды. Активным веществом в нем является экстракт из печени утки, который двести раз последовательно разводили в сто раз. Это еще более невероятное разведение, чем у антител в «Анафероне». Печени одной утки хватило бы на то, чтобы лечить «Оциллококцинумом» всех людей на нашей планете до тех пор, пока Солнце не поглотит ее. Причем даже триллионная доля этой печени не будет к тому моменту израсходована. Впрочем, у «Материи Медики» есть препарат от алкоголизма — «Пропротен-100», где активное вещество наносится на лактозу после разведения 10-1991 нг/г. Так что битва у сахарных титанов почти равная.

Закон никак не препятствует такому положению дел. Общая фармакопейная статья «Лекарственные формы ОФС для гомеопатических лекарственных препаратов», в соответствии с требованиями которой по федеральному закону «Об обращении лекарственных средств» (Федеральный закон от 12 апреля 2010 года № 61-ФЗ, действующая редакция от 28.12.2017) должен производиться такой препарат, содержит следующую поблажку: «В том случае, если степень разведения активного компонента не позволяет определить подлинность или количественное содержание, качество препарата оценивают по вспомогательным веществам». Уверен, что сахар в этих продуктах используется качественный.

В этих невероятных разведениях (якобы усиливающих эффективность средства) — вся суть гомеопатии (не путать с фитотерапией — лечением травами). Но если «Оциллококцинум» открыто называется гомеопатическим средством, то «Материа Медика» пошла по другому пути. Как минимум два препарата компании («Анаферон» и «Импаза») изначально были зарегистрированы в России как гомеопатические, но в 2009 году слово «гомеопатия» исчезло из их названия. Поэтому в шутку мы будем называть «релиз-активные» препараты «стыдливой» гомеопатией.Но шутка уже не кажется столь смешной, когда узнаешь, что такими препаратами предполагают лечить не только простуду, но и клещевой энцефалит, импотенцию, диабет, болезни суставов, эректильную дисфункцию, нарушения сна, ожирение, синдром дефицита внимания, хроническую церебральную ишемию, алкоголизм, аллергии, доброкачественную гипертрофию простаты, а также решать многие другие проблемы со здоровьем.Классической гомеопатия руководствуется принципом «подобное лечить подобным»: пациенту назначают разбавленный препарат, который в неразбавленном виде вызывает симптомы, подобные тем, что он испытывает. У стыдливой гомеопатии этот магический ритуал оброс наукообразием и терминами из молекулярной биологии. Например, для лечения диабета разбавлять надо антитела к рецепторам инсулина. Для лечения эректильной дисфункции — антитела к ферменту NO-синтазе, производящей оксид азота — сигнальную молекулу, вызывающую расслабление гладкой мускулатуры кровеносных сосудов. Для лечения вирусных инфекций — уже упомянутые антитела к интерферону — молекуле, участвующей в противовирусном ответе организма. Самое смешное, что даже если бы разведения антител были не столь фантастическими, их наиболее вероятная судьба, при оральном применении, — простое переваривание.При всей антинаучности таких принципов, логика Эпштейна крайне проста. Хотите придумать свой псевдонаучный релиз-активный препарат и заработать миллиарды? Держите рецепт! Выберите какую-нибудь молекулу в теле человека, которая участвует в каком-нибудь процессе, имеющем отношение к болезни. Возьмите к ней антитела и разведите их много-много раз, нанесите на сахарный шарик и съешьте. Например, ВИЧ проникает в клетки иммунной системы, взаимодействуя с определенными рецепторами на их поверхности. Берем антитела к этим рецепторам, разбавляем — и лекарство от ВИЧ готово! Лекарство от рака? Не проблема! Часто в раковых клетках ломается ген, кодирующий белок p53 — он ограничивает деление клеток, когда их ДНК повреждается. Значит, нужны антитела к нему. Остается лишь вылечить старость антителами к теломеразе — ферменту, удлиняющему кончики хромосом, которые укорачиваются в клетках стареющего организма.

То, что релиз-активные препараты зарегистрированы и продаются в России, увы, говорит о глубоком кризисе отечественной системы здравоохранения и необходимости пересмотра критериев одобрения лекарственных препаратов. Когда Комиссия по борьбе с лженаукой и фальсификацией научных исследований выпустила меморандум о лженаучности гомеопатии, Минздрав заявил о планах по созданию особой экспертной группы, которая рассмотрит приведенные возражения. Такая группа так и не была создана — во всяком случае, члены Комиссии по борьбе с лженаукой о ней ничего не слышали. Мы опасаемся, что бездействие Минздрава может быть связано с тем, что влияние производителей сахарных таблеток оказалось слишком большим.

Зато Министерство образования и науки Российской Федерации недавно присудило «Материи Медике» «Антипремию» за распространение лженауки. Это не первый скандал с участием данной компании. В 2017 году под шквалом гневных писем ученых и студентов организаторы Дня биолога (традиционного праздника биологического факультета МГУ) отозвали приглашение представителей «Материи Медики» со следующими словами: «Ваши комментарии пробудили дух справедливости в команде, мы проверили информацию и пришли к коллективному решению, которое также поддержала администрация, что выступление компании с такой репутацией на биологическом факультете недопустимо».

Хорошо, что хоть кто-то выступает против магии XXI века, выдающей себя за науку и медицину. Каждый пациент имеет право знать, имеет ли препарат доказанную эффективность или является пустышкой, которая, согласно современным научным представлениям, не может работать. Комиссия по борьбе с лженаукой — общественная организация, не имеющая финансирования, поэтому нам сложно противопоставить что-то рекламным мощностям гомеопатов и «стыдливых гомеопатов». Вся надежда на то, что читатели сами расскажут об этой проблеме своим друзьям и родственникам. Только вместе мы сможем победить стыдливое мракобесие.

Данная статья написана мной для научно-популярного издания «Чердак». Оригинал: https://chrdk.ru/other/materia-medica

Tags: гомеопатия, лженаука, мракобесие

scinquisitor.livejournal.com

Антитела к морфину аффинно очищенные

Опийный абстинентный синдром легкой и средней тяжести (может использоваться в качестве средства монотерапии).

Гиперчувствительность, препарат не предназначен для применения у лиц до 18 лет.

На один прием держать во рту до полного растворения 1 таблетку. В первые часы лечения прием осуществлять каждые 20 мин - до появления сна или сонливости. После пробуждения принимать по 1 таблетке через 40 мин.

При улучшении состояния (обычно с 4 дня терапии) достаточно принимать препарат 6-8 раз в день. Средний курс лечения - до 7 дней.

Может использоваться для монотерапии. При отсутствии значимого эффекта в течение 4-6 ч лечения продолжать принимать препарат совместно с ЛС, традиционно используемыми для лечения опийного абстинентного синдрома (что позволяет сократить объем необходимой терапии и сроки ее применения).

Гомеопатический препарат, улучшает функциональное состояние церебральных структур (миндалевидный комплекс, орбитофронтальная кора, гиппокамп), снижая выраженность стресс-абстинентного синдрома. Нормализует поведение, оказывает анксиолитический эффект, повышает порог болевой чувствительности.

Облегчает соматовегетативные (озноб, зевота, слезотечение, повышенное потоотделение и др.), неврологические (тремор, артралгия, миалгия), психопатологические (раздражительность, тревожность, эмоциональная напряженность), симптомы опийного абстинентного синдрома. Способствует наступлению сна.

Аллергические реакции. В первые часы приема редко - снижение АД (на 10-15 мм рт.ст.), головокружение, кратковременные нарушения координации движений, парестезии и жжение кожи.

Взаимодействие с антагонистами морфина не изучалось.

Приведенная информация предназначена для медицинских и фармацевтических специалистов. Наиболее точные сведения о препарате содержатся в инструкции, прилагаемой к упаковке производителем. Никакая информация, размещенная на этой или любой другой странице нашего сайта не может служить заменой личного обращения к специалисту.

* Наш сайт не осуществляет торговлю лекарствами и иными товарами, они должны приобретаться в аптеках, в соответствии с действующими законами. Данные о ценах и наличии в аптеках обновляются два раза в сутки. Актуальные цены всегда можно увидеть в разделе Поиск и заказ лекарств в аптеках.

www.webapteka.ru

Перспективы терапии антителами в сверхмалых дозах.

20 октября 2002 18:05

В последние годы наметилась тенденция к синтезу двух, до недавнего времени антагонистических областей медицины – фармакотерапии и гомеопатии.

На сегодняшний день «примирить» гомеопатию с рациональными биологическими и фармакологическими подходами, прежде всего, может технологический фактор.

В гомеопатии применяются сверхразбавленные растворы, подвергшиеся особому процессу – потенцированию.  Последнее представляет собой последовательное разведение исходного раствора в сочетании с внешним физическим воздействием. Не подвергшиеся процессу потенцирования растворы, содержащие сверхмалые дозы лекарственных средств, биологической активностью не обладают.

Исследования потенцированных средств в гомеопатических дозах позволяют определять у них наличие тонкой молекулярно-клеточной активности, вполне доступной изучению современными экспериментальными методами. Молекулярно-клеточные эффекты лекарственного вещества в терапевтических и сверхмалых дозах качественно идентичны, но выраженность этих эффектов слишком мала и не позволяет заменить терапевтические дозы лекарственных средств на гомеопатические.  Эффективность лечения потенцированными лекарственными средствами в классической гомеопатии достигается за счет максимальной индивидуализации терапии (принцип подобия), позволяющей вызывать у чувствительных к ним больных гиперергические по сути реакции на вводимые сверхмалые дозы.

Однако, изучение потенцированных препаратов, проводимое в течение 6 лет ПФ «Материа Медика», показало, что сверхмалые дозы можно использовать и вне рамок гомеопатической концепции. Потенцирование не только сохраняет в сверхразбавленных растворах биологическую активность, но и придает всем потенцированным препаратам особые групповые свойства. 

На сегодняшний день наиболее изученным из потенцированных антительных препаратов является «Пропротен-100», содержащий потенцированные антитела к мозгоспецифическому белку S-100 (AS-100). Препарат исследован на всех уровнях организации нейрональных структур: клеточном, межклеточном (синаптическом), структурном, системном. Наиболее важным для понимания механизмов действия AS-100 можно считать их сенситизирующее влияние на клеточную мембрану нейронов. Необычные биологические свойства «Пропротена-100» на клиническом уровне проявляются сбалансированным воздействием на психический статус больных. В зависимости от исходного состояния пациентов, препарат оказывает как седативное, так и стимулирующее действие.  Экспериментально на моделях самостимуляции показано, что AS-100 оказывают анксиолитический, ноотропный и антидепрессивный эффекты. Также установлено, что препарат гармонизирует эмоциональную сферу, вызывая принципиально новый эффект – активацию системы позитивного эмоционального подкрепления без формирования зависимости к препарату. Именно это свойство послужило основанием для регистрации «Пропротена-100» в качестве противоалкогольного средства. Препарат выпускается более года и уже достаточно широко применяется как для лечения алкогольного абстинентного синдрома, так и влечения к алкоголю (профилактика рецидивов). В качестве средства для лечения опийного абстинентного синдрома фирмой предложены антитела к морфину (препарат «Анар»). Экспериментально показано, что препарат оказывает модифицирующее воздействие на функциональное состояние структур мозга, активность которых изменяется при морфинной зависимости.

Использование потенцированных антител в терапевтической практике представляется крайне перспективным направлением по целому ряду причин. Во-первых, использование в качестве лекарственного средства антител к известным антигенам, с хорошо изученной активностью, в значительной мере облегчает процесс фармакологического скрининга. Во – вторых, исследования показали, что сверхмалые дозы антител, в том числе  к наркотическим средствам,  не вызывают привыкания и пристрастия. Подтверждением этого служат результаты проводимых под эгидой фирмы экспериментального изучения потенцированных антител.

В результате доклинических исследований выявлено, что потенцированные антитела к гамма-интерферону человека, вошедшие в состав разрабатываемого препарата «Анаферон», обладают свойствами иммуномодулятора: стимулируют гуморальный иммунный ответ (повышают функциональную активность АОК в селезенке, титр специфических антител в сыворотке). Эффективны при вторичном иммунодефицитном состоянии, в частности, на фоне иммуносупрессии цитостатиком циклофосфаном. Препарат стимулирует реакции клеточного иммунитета – активизирует функцию Т-эффекторов (усиление реакции  гиперчувствительности замедленного типа); повышает способность Т-лимфоцитов селезенки продуцировать g-интерферон; влияют и на фагоцитарное звено иммунитета — усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов за счет увеличения процента активных фагоцитов; оказывают умеренное стимулирующее влияние на функциональную активность NK-клеток. Таким образом, потенцированные антитела к гамма-интерферону обладают комплексным влиянием на все звенья иммунной системы, включая регуляторные и эффекторные клетки, а также фагоцитарное звено.

В настоящее время фирма завершает доклинические исследования следующих перспективных препаратов:

Артрофоон – аффинно очищенные антитела к человеческому фактору некроза опухоли – альфа; смесь гомеопатических разведений С12, С30,С200. Препарат оказывает противовоспалительное, анальгезирующее, метаболическое действие. Ингибирует синтез противовоспалительных медиаторов, улучшает  трофику тканей. При комплексной терапии сокращает сроки лечения и позволяет снизить дозы традиционных лекарственных препаратов, используемых для лечения заболеваний суставов.

Афала – аффинно очищенные антитела к простатоспецифическому антигену; смесь гомеопатических разведений С12,С30,С200. Препарат обладает выраженным простатотропным действием: оказывает противовоспалительный и противоотечный эффекты в отношении предстательной железы, нормализует функциональное состояние простаты при воспалении, улучшает трофику железы.

Импаза – аффинно очищенные антитела к эндотелиальной NO – синтазе; смесь гомеопатических разведений С12, С30, С200. Препарат восстанавливает нарушенную эректильную функцию. Регулирует синтез окиси азота (NO) в пещеристом теле, усиливает расслабляющее действие NO на гладкие мышцы кавернозного тела и увеличивает кровоток в половом члене при сексуальной стимуляции.

Доклинические исследования также подтвердили отсутствие эмбриотоксичности, тератогенности и мутагенности у новых препаратов.

Уважаемые коллеги!  Препараты нашей фирмы имеются в продаже в аптеках г. Москвы.

Если Вас заинтересовала представленная информация или у Вас возникли вопросы просим обращаться по телефону: 298−56−94.

20 октября 2002  |  18:10

Лондонский факультет гомеопатии в Москве.

Предлагает пройти обучение методу гомеопатии у ведущих специалистов Лондонского Факультета по специально разработанной для России программе. Российская программа обучения Факультета предусматривает:

20 октября 2002  |  18:10

Гомеопатия сегодня.

– Официальной датой появления гомеопатии как раздела медицины считается 1796 год. Тогда была опубликована работа основателя этого метода Самюэля Ганеманна, которая сокращенно называется «Опыт

20 октября 2002  |  17:10

Институт гомеопатии.

Леонид Владимирович Космодемьянский, ректор Института гомеопатии МГЦ: – В 1936 году в Москве открылась гомеопатическая поликлиника, костяк которой составили опытные врачи-практики. Но сразу же

28 августа 2002  |  03:08

СЫВОРОТОЧНАЯ БОЛЕЗНЬ

 Сывороточная болезнь возникает при контакте организма с гетерологической, обычно лошадиной, сывороткой. Естественно летом, когда людей преследуют травмы, сыворотки, в частности противостолбнячная,

www.medicus.ru

Исследование влияния аффинно очищенных антител к эндоканнабиноидному рецептору на функциональное состояние эндотелия при экспериментальной инсулинорезистентности Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

БИОХИМИЯ

© ЗАГАЙКО А.Л., БРЮХАНОВА Т.А., 2016

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ АФФИННО ОЧИЩЕННЫХ АНТИТЕЛ К ЭНДОКАННАБИНОИДНОМУ РЕЦЕПТОРУ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЭНДОТЕЛИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ

ЗАГАЙКО А.Л., БРЮХАНОВА Т.А.

Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина Вестник ВГМУ. - 2016. - Том 15, №2. - С. 27-33.

THE STUDY OF THE INFLUENCE OF AFFINELY PURIFIED ANTIBODIES AGAINST ENDOCANNABINOID RECEPTOR ON ENDOTHELIUM FUNCTIONAL STATUS IN EXPERIMENTAL INSULIN RESISTANCE

ZAGAYKO A.L., BRIUKHANOVA T.A.

National University of Pharmacy, Kharkov, Ukraine Vestnik VGMU. 2016;15(2):27-33.

Резюме.

Метаболический синдром (МС) связан с высоким риском развития сердечно-сосудистых осложнений на его фоне. Формирование кардиоваскулярного континуума обусловлено возникновением эндотелиальной дисфункции (ЭД), которая характеризуется дисбалансом продукции вазоконстрикторных и вазодилатиру-ющих факторов, с преобладанием последних. Согласно данным ряда авторов, активация эндоканнабино-идной системы (ЭКС) играет немаловажную роль в патогенезе развития ЭД. В связи с этим, целью нашей работы было изучение влияния препарата на основе аффинно очищенных антител к эндоканнабиноидному рецептору 1 типа на отдельные показатели функционального состояния эндотелия при экспериментальной инсулинорезистентности (ИР) у крыс.

Материал и методы. В эксперименте использовали крыс-самцов линии Wistar, которых содержали на пищевом рационе, обогащенном фруктозой, и на фоне высокофруктозной диеты в течение 10 недель вводили внутрибрюшинно низкие дозы дексаметазона, что приводило к формированию ИР. Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно в течение 3 недель. В крови животных определяли содержание S-нитрозотиолов (S-NO), эндотелина-1 (ЭТ-1) и их соотношение. Исследования проводили согласно действующим принципам биоэтики.

Результаты и обсуждение. Длительное введение низких доз дексаметазона на фоне диеты с высоким содержанием фруктозы приводило к формированию синдрома ИР. У животных группы МП достоверно повышалось содержание ЭТ-1 (в 2,62 раза) при одновременном снижении содержания S-NO. (в 4,08 раз) относительно показателей здоровых животных. Расчет коэффициента соотношения ЕТ-1/S-NO свидетельствовал о развитии дисфункции эндотелия на фоне ИР. На фоне применения исследуемого препарата наблюдалась схожая, хотя и менее выраженная динамика изучаемых показателей, что, вероятно, обусловлено механизмом действия препарата.

Заключение. Динамика показателей ЭД при экспериментальной ИР свидетельствует о перспективности поиска новых методов коррекции обозначенных изменений для предотвращения развития кардиоваску-лярных осложнений на фоне МС.

Ключевые слова: эндоканнабиноиды, эндотелиальная дисфункция, метаболический синдром, инсулинорези-стентность.

Abstract.

Objectives. Metabolic syndrome (MS) is associated with the high risk of cardiovascular complications development

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

on its background. Cardiovascular continuum formation is due to endothelial dysfunction (ED) occurrence that is characterized by the imbalance of vasoconstrictor and vasodilator factors production, with the prevalence of the latter ones. According to several authors' data, activation of endocannabinoid system (ECS) plays an important role in the ED pathogenesis. Therefore, the aim of our work was to study the effect of the drug based on affinely purified antibodies against type 1 endocannabinoid receptor, on certain parameters of endothelium functional status in the rats with experimental insulin resistance (IR).

Material and methods. Wistar male rats which had been kept on the diet enriched by fructose were used in the experiment. Intraperitoneal administration of low dexamethasone doses during 5 weeks on the background of the diet with high fructose content resulted in the IR development. The studied drug was administered intragastrically during 3 weeks. The content of S-nitrosothiols (S-NO), endothelin-1 (ET-1) and their ratio in the blood were determined. The investigations were carried out according to the current principles of bioethics. Results. Long-term administration of dexamethasone low doses on the background of the diet with high fructose content led to the formation of IR syndrome. Animals with MS showed a statistically reliable increase of ET-1 content (2,62 times) with the simultaneous reduction of S-NO content (4,08 times) with regard to the indices of healthy animals. The calculation of the relationship coefficient of ET-1/S-NO testified to the development of endothelial dysfunction on the IR background. A similar though less pronounced dynamics of the examined parameters against the background of the studied drug application was observed that was probably due to the mechanism of the drug action.

Conclusions. The dynamics of ED indicators in experimental IR signifies that the search for the new methods to correct the designated changes for the prevention of cardiovascular complications development against MS is promising.

Key words: endocannabinoids, endothelial dysfunction, metabolic syndrome, insulin resistance.

Высокая социальная значимость метаболического синдрома (МС) обусловлена в первую очередь тем, что характерным осложнением этой патологии является развитие про-атерогенных изменений липидного обмена, формирование атеросклероза и возникновение кардиоваскулярных осложнений. МС как мультиморбидная патология имеет многогранный патогенез, многие звенья которого тесно связаны с нарушением функционального состояния эндотелия [1-3].

Патологическое состояние, сопровождающееся нарушением соотношения в продукции вазодилатирующих (стабильные метаболиты оксида азота, простациклин, эн-дотелиальный фактор поляризации и др.) и вазоконстрикторных (эндотелин-1, тромбок-сан А2, простагландин Н2 и др.) факторов с увеличением содержания последних, классифицируется как эндотелиальная дисфункция (ЭД) [4-5]. Данные эпидемиологических исследований свидетельствуют о ключевой роли ЭД в патогенезе ряда заболеваний и осложнений, среди которых - кардиоваскулярный континуум, нарушения мозгового кровообращения, поражения почек и др. [6-7]. Согласно мнению ряда авторов, активация эндоканнабиноидной системы (ЭКС) играет важную роль в патогенезе ЭД, наряду с метаболическими нарушени-

ями, которые имеют место при МС (дисбаланс цитокинов, секретируемых жировой тканью; интенсификация свободнорадикальных процессов и т.д.) [8-10].

Механизм ассоциации активности ЭКС и развития ЭД многовекторный, включает несколько основных направлений взаимодействия. Как известно, каннабиноидные рецепторы первого и второго типа (СВ-1 и СВ-2 соответственно) оказывают существенное им-муномодулирующее влияние (СВ-рецепторы обнаружены на мембране различных имму-нокомпетентных клеток), а также сопряжены с регуляцией стресс-лимитирующих систем, очевидна их роль и в механизмах устойчивости к проатерогенным факторам [11]. Учитывая, что при атерогенезе одной из ключевых составляющих патогенеза является развитие воспаления, модуляция активности СВ-1 и СВ-2 может потенциально корректировать проатерогенные изменения через влияние на иммунную систему. Результаты ранее проведенных исследований демонстрируют наличие антиатерогенных свойств у эндогенных и экзогенных каннабиноидов. В работах Steffens и соавт. было показано снижение выраженности атеросклеротического поражения корня аорты и брюшной аорты при экспериментальном атеросклерозе у мышей путем снижения адге-

зии моноцитов и инфильтрации субэндотели-альной области через стимуляцию СВ-2 рецепторов моноцитов при введении низких доз (1 мг/кг/сутки) 9-тетрагидроканнабинола (ТГК) [10]. В дальнейшем эти результаты были подтверждены в опытах in vitro: ингибирование хемотаксиса макрофагов в ответ на действие моноцитарного хемоаттрактант белка-1 в присутствии ТГК. Предполагается, что анти-атеросклеротическое действие каннабиноидов может быть обусловлено подавлением Th2 иммунного ответа и снижением экспрессии ци-токинов. Кроме того, предполагаемый механизм уменьшения выраженности атерогенеза может базироваться на снижении экспрессии генов провоспалительных цитокинов и уменьшении индуцированного активацией NF-kB окисления липопротеинов низкой плотности [10].

Результаты нескольких исследований предоставляют доказательства роли блокады СВ-1 в модуляции воспаления при атеросклерозе. В своем исследовании Sugamura и соавт. обнаружили достоверно более выраженную экспрессию СВ-1 в коронарной артерии пациентов с атеросклерозом на фоне нестабильной стенокардии в сравнении с пациентами с атеросклерозом и стабильной стенокардией. Ряд исследований in vitro также подтверждает взаимосвязь СВ-1 и формирования воспаления, опосредующего атерогенез. Блокада СВ-1 рецепторов в культуре человеческих макрофагов коррелировала с уменьшением экспрессии матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9) и провоспалительных цитокинов, а плотность СВ-1 рецепторов напрямую зависела от повышения экспрессии скавенджер-рецептора типа А. Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о многообразии возможностей для воздействия на СВ-1 и СВ-2 рецепторы макрофагов для уменьшения выраженности воспаления и, соответственно, прогрессирования атеросклероза [12].

Кроме воспаления, важнейшая роль в формировании атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний принадлежит ЭД. СВ-1 рецепторы были выявлены в эндотелиальных клетках аорты человека, и в опытах in vitro было продемонстрировано, что активация обозначенного типа рецепторов ведет к увеличению содержания активных форм кислорода (АФК), активации МАРК-киназ и окислитель-

ному повреждению клеток, но при этом эти эффекты устранялись путем блокады СВ-1 [1314]. В работах Яа]е8к и соавт. изучалась роль стимуляции СВ-2 рецепторов эндотелиальных клеток при действии провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухли-а (ФНО-а) и эндотоксина). Было показано, что агонисты СВ-2 рецепторов уменьшают выраженность воспаления в ответ на ФНО-а, что приводило к снижению экспрессии межклеточной молекулы адгезии-1, молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа, моноцитарного хе-моаттрактант белка-1 эндотелиальных клеток; снижению адгезии и трансэндотелиальной миграции моноцитов. Таким образом, роль каннабиноидных рецепторов является дихо-томичной при ЭД - агонизм СВ-1 рецепторов способствует формированию проатерогенных изменений, а СВ-2 рецепторов - подавляет их выраженность. Учитывая вышеприведенные данные, представлялось актуальным изучить влияние препарата аффинно очищенных антител к эндоканнабиноидному рецептору на функциональное состояние эндотелия при экспериментальном МС [9, 15].

Материал и методы

В качестве экспериментальных животных использовали крыс-самцов линии массой 160-200 г, которых содержали на пищевом рационе, обогащенном фруктозой, и на фоне высокофруктозной диеты в течение 10 недель вводили внутрибрюшинно низкие дозы дексаметазона, что приводило к формированию инсулинорезистентности, которая является основным патогенетическим звеном МС [16].

Экспериментальных животных разделили на 3 группы в зависимости от целей эксперимента (по 10 животных в группе): интактный контроль - ИК (здоровые животные, которые содержались на стандартном пищевом рационе вивария); модельная патология - МП (животные, пищевой рацион которых содержал 29% жира (преимущественно насыщенные ли-пиды) с добавлением фруктозы (1 г в сутки на 100 г массы тела) на фоне ежедневного внутри-брюшинного введения дексаметазона в дозе 1,5 мг/кг на протяжении 10 недель; животные, которым на фоне высококалорийной диеты и введения дексаметазона по вышеописанной

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

схеме ежедневно и в течение 3 недель (начиная со 2 недели диеты) вводили внутрижелудоч-но препарат на основе аффинно очищенных антител к эндоканнабиноидному рецептору в эффективной терапевтической дозе (с учетом коэффициента видовой устойчивости).

Исследования проводили согласно «Общим этическим принципам экспериментов на животных» (Украина, 2001), которые согласованы с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985) и Этическим Кодексом Всемирной Медицинской ассоциации (Хельсин-ская декларация, 1964). В сыворотке крови животных исследовали содержание стабильных метаболитов оксида азота - Б-нитрозотиолов ^-N0), эндотелина-1 (ЭТ-1), их соотношение. Содержание Б-МО определяли спектрофлюо-риметрическим методом. Концентрацию ЭТ-1 определяли иммуноферментным методом с помощью набора реактивов ОЯО, производства Германии). Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы БТАИЗИСЛ (81а18оШпе., США, версия 6.0). Значимость межгрупповых различий оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Длительное введение низких доз декса-метазона на фоне диеты с высоким содержанием фруктозы приводило к развитию ряда патологических изменений метаболических звеньев, определяемых как синдром инсули-норезистентности (ИР) [1]. Снижение чувствительности тканей к действию инсулина является основой патогенеза МС и ряда других ассоциированных с ним заболеваний. Соглас-

но данным, которые были получены в наших предыдущих исследованиях и согласуются с данными литературы, высокофруктозная диета и продолжительное внутрибрюшинное введение дексаметазона сопровождаются формированием выраженной гипергликемии и ги-перинсулинемии, атерогенной дислипидемии [1-2, 17]. В соответствии с данными научной литературы, при таких условиях происходит гиперактивация ЭКС, что сопровождается нарушениям обмена эндогенных каннабино-идов, что является пусковым фактором в развитии ожирения, усугубления течения МС и формирования осложнений со стороны сердечно-сосудистой системы [18].

Поскольку ЭД рассматривается как одна из ключевых причин развития кардиоваску-лярных осложнений, представляло интерес оценить влияние препарата на основе аффин-но очищенных антител к эндоканнабиноидно-му рецептору 1 типа на содержание отдельных показателей функционального состояния эндотелия. Результаты исследования показывают, что у животных группы МП достоверно повышалось содержание вазоконстрикторно-го фактора - ЭТ-1 (в 2,62 раза относительно показателей здоровых животных). При этом содержание стабильных метаболитов N0, проявляющих вазодилатирующее действие существенно снижалось (в 4,08 раз относительно ИК). Расчет коэффициента соотношения ЕТ-1/Б-М0 свидетельствовал о развитии дисфункции эндотелия на фоне ИР (табл. 1).

Такая динамика изменений ЭТ-1 и Б-МО у животных группы МП была обусловлена развитием ИР: гипергликемия и гиперинсу-линемия провоцировали патологические изменения активности МО-синтазной системы. Кроме того, гипергликемия опосредовала дисбаланс антиоксидантно-прооксидантных фак-

Таблица 1 - Влияние препарата на основе аффинно очищенных антител к эндоканнабино-идному рецептору 1 типа на отдельные показатели эндотелиальной функции у крыс при экспериментальном метаболическом синдроме, п=10

Показатели ИК МП Диетресса+МП

ЭТ-1, пкг/мл 2,29±0,14 6,02±0,15* 4,15±0,08*/**

§-N0, ммоль/л 0,49±0,03 0,12±0,02* 0,32±0,03*/**

ЕТ-1/8-Ш 4,67±0,13 50,2±1,08* 12,96±0,25*/**

Примечание: * - изменения достоверны относительно показателей ИК (р

cyberleninka.ru


Смотрите также